De: Mike Darwin & lt; 75120.575@compuserve.com Fecha: 31 de mayo de 95 00:03:14 EDT Asunto: SCI.CRYONICS BPI Tech Brief 16: Criopreservación del cerebro canino Un breve resumen a nivel de laicos del cerebro canino de la biopreservación Resultados de la criopreservación por Charles Platt En la década de 1950, los experimentos mostraron que el daño causado cuando las células de un mamífero se congelan pueden reducirse si las células primero se tratan con una solución de glicerol. Más recientemente, el trabajo de Leaf, Darwin, et. Alabama. sugerido que El daño a los pacientes criónicos podría minimizarse aún más si La perfusión con glicerol se controló cuidadosamente y controlado, utilizando una solución cuya concentración gradualmente aumentado durante el proceso de perfusión a una concentración muy alta donde se formará mucho menos hielo que cuando no hay crioprotector o se utilizan niveles más bajos de crioprotector. Hasta ahora, no se ha realizado ningún estudio sistemático para verificar que este tipo de perfusión controlada de pacientes criónicos realmente resulta en menos daño por congelación que un protocolo más simple. En particular, nadie trató a los animales de laboratorio con la exacta mismo protocolo que se utiliza actualmente en criónica humana pacientes por BioPreservation o la Fundación Alcor. (Nota: ACS puede usar un protocolo diferente en el futuro, ya que no es más tiempo empleando BioPreservation para manejar sus casos, y El Cryonics Institute (CI) tiene una política de larga data de minimizando todos los procedimientos médicos en sus pacientes. CI lo hace algo de glicerolización, pero normalmente se aplica mediante un funerario con equipo no médico, y la concentración es no incrementado y monitoreado usando equipo del tipo empleado por BioPreservation y Alcor.) Hace más de un año, decidimos llevar a varios perros a nuestro protocolo criónico, manténgalos congelados durante 12 a 18 meses en temperaturas relativamente altas (hielo seco que es -79xC), caliéntelas, y luego busque daño cerebral usando microscopía óptica y electrónica. Los perros fueron anestesiados y se indujo un paro cardíaco durante inconsciencia. Luego, a los animales se les dio un breve período de isquemia cálida (falta de flujo sanguíneo) a temperatura corporal normal (37xC) simulando la espera tiempo & quot; que un paciente criónico puede experimentar después de que se pronuncia la muerte, antes de que se apliquen los protocolos criónicos. Luego se les dio a los perros apoyo cardiopulmonar mediante un & quot; thumper & quot; del mismo tipo que nosotros emplear en pacientes criónicos, y se administraron nuestros medicamentos habituales. El lavado de sangre y la perfusión con glicerol fueron idénticos a los procedimientos que usamos en pacientes humanos. Después de congelar, almacenar durante un año o más y descongelar, enviamos muestras de tejido cerebral para su examen. Los siguientes informes en papel nuestros resultados, que fueron mucho más alentadores de lo que esperábamos. En todos los casos, el daño se redujo considerablemente en comparación con nuestros resultados anteriores a mediados de la década de 1980 usando crioprotección de glicerol 3-4M) o que los resultados que se obtuvieron (basados en nuestro examen del IC imágenes de microscopio óptico y electrónico) el año pasado por el Cryonics Institute, que financió experimentos en los que los cerebros de las ovejas se sometieron a CI más simple protocolo de perfusión. Nuestros resultados han sido examinados por un destacado criobiólogo, y ahora creemos firmemente que nuestro protocolo de perfusión no Minimice los daños que de otro modo ocurrirían. Sin embargo, observamos que en nuestro modelo, asumimos que una criónica El paciente puede recibir atención solo cinco minutos después de la muerte. pronunciado. Ha habido muchos casos en los que esto no fue posible (por ejemplo, cuando los pacientes murieron repentinamente y inesperadamente), y creemos que períodos más largos de isquemia El tiempo en tales casos probablemente cause un daño mucho mayor al integridad de los tejidos en el cerebro. -------------------------------------------------- ----------- CRIOPRESERVACIÓN HUMANA PROTOCOLO SOBRE LA ULTRASTRUCTURA DEL CEREBRO CANINO por Michael Darwin, Sandra Russell, Larry Wood y Candy Wood I. Introducción II. Materiales y métodos III. Efectos del soporte cardioipulmonar de tórax cerrado IV Efectos de la glicerolización V. Efectos brutos del enfriamiento y el recalentamiento desde -90 C VI. Efectos de la criopreservación en la ultraestructura cerebral VII. Resumen y discusión I. INTRODUCCIÓN La criopreservación clínica humana tiene como objetivo la preservación de estructuras cerebrales que codifican personal identidad suficiente para permitir la reanimación o reconstrucción del individuo debe ser molecular realización de la nanotecnología (1,2). Aparte del pionero trabajo de Suda, et al (3,4) y tres estudios previos realizado por organizaciones criónicas (5,6,7) ha habido virtualmente ningún esfuerzo sistemático para examinar la fidelidad de la preservación ultraestructural del cerebro: particularmente en el nivel del neuropil y sináptico e intra-sináptico estructuras después de la criopreservación mediante uso clínico (humano) técnicas de criopreservación (`` suspensión criónica '') en un modelo animal o de cadáver. Estudios ultraestructurales previos realizados por Cryovita Laboratorios en conjunto con Alcor Life Extension Fundación a mediados de los 80 y más recientemente por Pichugin, et al., bajo los auspicios del Cryonics Institute han mostró una ruptura masiva de la ultraestructura en todos los niveles. (5,6) Un breve resumen de las lesiones observadas en estos estudios reveló los siguientes tipos de lesiones que ocurren uniformemente a lo largo de la materia blanca y gris del cerebro corteza en gatos (Darwin, et al) y ovejas (Pichugin, et al): a) desgarro y deshilachado a nivel ultraestructural del rasgado extremos de los tractos nerviosos por contracción osmótica de células acopladas con el empuje del hielo extracelular creando escombros esparcidos huecos a intervalos de 5 a 100 micrones de ancho; b) separación de los capilares del cerebro circundante tejido (visible tanto en el estado congelado con congelación sustitución y al descongelar después de la fijación y incrustación); c) rotura física de los capilares debido a formación de hielo intracapilar, lisis de las células endoteliales con núcleos de células endoteliales adherentes ocasionales, y separación de las células endoteliales del basamento capilar membrana; d) Separación de mielina de axones, formación de espacios entre la membrana del axón y la mielina, desintegración de la mielina, y pérdida frecuente de material intraaxonal, posiblemente como un resultado de la interrupción del axolema; e) Desorganización extensa del neuropilo y del plasma membrana de células neuronales y gliales con conversión de estructura de la membrana intracelular y sináptica en amorfa escombros o vesículas vacías y / o que contienen escombros. El principal objetivo de este estudio fue analizar los efectos de glicerolización a una concentración mucho más alta que la que se ha utilizado en el pasado, principalmente glicerol 7,4 M versus glicerol 4 a 5 M, congelación a -90 C, almacenamiento a esta temperatura durante un período de por lo menos 1 año, y recalentamiento a diferentes velocidades, en la estructura bruta, histología y ultraestructura del cerebro canino utilizando una preparación Protocolo similar al que se usa ahora en la criopreservación humana. pacientes por BioPreservation, Inc. de Rancho Cucamonga, California. El trabajo descrito en este trabajo se realizó a partir de octubre de 1993. a mayo de 1995. La técnica utilizada para la criopreservación de animales en Este estudio es muy paralelo al utilizado por BioPreservation (8) y por la Fundación Alcor Life Extension de Phoenix, AZ (9) en preparación de pacientes humanos para la criopreservación a largo plazo. Cabe señalar que la formación del personal en procedimientos de transporte (soporte cardiopulmonar de tórax cerrado), cuerpo entero lavado (TBW) y perfusión crioprotectora y congelación de los pacientes humanos con criopreservación fue un segundo objetivo importante de este estudio. II. MATERIALES Y MÉTODOS Procedimientos de preperfusión Se utilizaron cinco perros adultos que pesaban entre 24 y 28 kg en este estudio. Todos los animales recibieron atención humanitaria en cumplimiento con los & quot; Principios del cuidado de animales de laboratorio & quot; formulado por la Sociedad Nacional de Investigaciones Médicas y la & quot; Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio & quot; preparado por el Institutos Nacionales de Salud (Publicación NIH No. 80-23, revisado en 1978). Antes de la inducción de la anestesia, los animales recibieron 0,5 mg / kg de maleato de acepromacina y 0,25 mg atropina IM. La anestesia en ambos grupos fue asegurada por el administración intravenosa de 40 mg / kg de sodio pentobarbital. Luego, los animales fueron intubados y colocados en un ventilador MA-1 ciclado por volumen con un volumen corriente de 15 cc / kg, PEEP de 5 cm H20 y FiO2 de 21. Se monitorizó el electrocardiograma durante todo el procedimiento hasta que se produjo un paro cardíaco. inducido. Las temperaturas rectal y esofágica fueron monitoreado continuamente durante la perfusión usando cobre sondas de termopar constantan de calibre 20 (instrumento Laboratorios 53-20-507). A 14 Charr. x 48 cm doble lumen La sonda gástrica de Salem Sump se pasó esofágicamente en el estómago (posicionamiento verificado fluoroscópicamente) para facilitar alcalinización del contenido del estómago con Maalox (hidróxido de aluminio suspensión) y prevenir la erosión de la mucosa gástrica durante los siguientes períodos de isquemia, hipoperfusión e hipotermia. Después de la colocación de las sondas de temperatura, se estableció una IV en la vena medial de la pata delantera y un goteo de Normosol-R (pH 7,4) a Se inició una tasa de 50 cc / h para mantener la permeabilidad de la vía intravenosa y apoyar el volumen de sangre circulante durante la cirugía. Luego, los animales se colocaron en un baño de hielo portátil (PIB) idéntico al utilizado para el transporte de pacientes humanos en criopreservación y El cofre se estabilizó en un soporte acolchado especialmente fabricado para permitir para la aplicación estable en el medio esternal de un Michigan Instruments Modelo # 1004 Thumper (compresor / ventilador cardíaco externo). (Figura 1) Protocolo quirúrgico Ambas ingles y el cuello derecho en toda la longitud de la vena yugular externa se afeitó y se preparó para la cirugía usando una solución de povidona yodada (Betadine). Dado que estos eran estudios de sacrificio, no se utilizó técnica estéril. sin embargo Se utilizaron guantes, batas y máscaras para proteger al personal de infección y simular las condiciones de trabajo reales con humanos casos. Por las mismas razones, se utilizó Betadine para simular la aparición de la piel preoperatoria y mata la flora cutánea minimizar el riesgo de infección en caso de lesiones cortopunzantes al personal. Se colocó un catéter Swan-Ganz de Edwards para adultos corte de la vena yugular derecha y estaba encajado en el arteria pulmonar. La línea proximal del Swan-Ganz El catéter estaba conectado a un Bentley Trantec 800 de presión transductor para medir la diastólica de la arteria pulmonar (PAD) y presiones de cuña, y el cable del termistor se conectado a una termodilución COM-1 de American Edwards Computadora de gasto cardíaco para facilitar la medición de la frecuencia cardíaca. producción (CO) y temperatura sanguínea central durante el poscardíaco paro cardiopulmonar Thumper. La posición del Se verificó catéter de Swan-Ganz en la arteria pulmonar tanto mediante la evaluación de la forma de onda de presión en un Tektronix 414 monitor fisiológico y fluoroscópicamente con Siemans Fluoroscopio de brazo en C Siremobile II de Siemens, Inc. Ambas ingles se cortaron para acceder a las arterias femorales y venas. Un Argyle 18 Fr. catéter de monitorización de presión conectado a una llave de paso Cobe de 4 vías se colocó en el lado derecho arteria femoral y conectado a través de una presión de Cobe de gran calibre línea de monitoreo a un transductor de presión Trantec 800 y Monitor Tektronix 413 para medir la arteria media presión (MAP). El retorno venoso se logró utilizando cánulas de USCI tipo 1967 de ya sea 21 o 22 Fr. diámetro que se colocaron en ambos venas femorales y colocadas bajo fluoroscopia: la derecha cánula venosa avanzando por la vena cava inferior (IVC) hasta aproximadamente el nivel de la aurícula derecha, el la cánula venosa izquierda avanzando aproximadamente al nivel de las venas renales. La perfusión arterial fue a través de instrumentos cardiovasculares. Cánula de acero inoxidable de 4.0 mm o 4.5 mm de DI colocada en el arteria femoral derecha. La colocación típica de la cánula se muestra en Figura 2. Circuito extracorpóreo El circuito extracorpóreo para los animales tratados con crioprotector (Figura 3) constaba de 1/4 '' (arterial) y 3/8 '' (venoso) médico tubería de cloruro de polivinilo de grado. El circuito estaba compuesto por dos secciones: un bucle de recirculación al que estaba conectado el animal y un sistema de adición de glicerol. El sistema de recirculación consistió de un depósito de polietileno de 20 litros colocado encima de un imán agitador con tapa flotante para evitar la entrada de aire (10), un bomba de rodillo arterial (recirculante) (máquina cardiopulmonar Sarns 5000 consola), un oxigenador / calor de membrana de fibra hueca pediátrica Sarns 16267 intercambiador y un filtro de sangre Pall LP 1440 de 40 micrones de 40 micrones. El depósito de recirculación se agitó continuamente con un 3 '' Barra de agitación magnética recubierta de teflón accionada por un Thermolyne tipo 7200 agitador magnético. La temperatura fue monitoreada continuamente en el puerto arterial del oxigenador usando un termistor de temperatura Sarns sonda y un termómetro digital de detección remota YSI 73BTAX. Se añadió continuamente concentrado de glicerol a la recirculación sistema de un depósito de polietileno de 60 litros utilizando un Drake-Willock Bomba de hemodiálisis 7401. La rampa de glicerol se controló utilizando un Atago refractómetro de azúcar de mano. Tres animales constituyeron el grupo experimental y fueron sometidos a transporte simulado, TBW, perfusión crioprotectora y congelación- descongelación y fijación. Controles perfundidos fijadores Se prepararon dos animales de control según lo anterior con lo siguiente modificaciones: Uno de los animales fue sometido a fijación después inducción de la anestesia y colocación de cánulas (es decir, normotérmica, fijación no isquémica, de corazón latiendo). Se logró la fijación perfundiendo primero al animal con 3 litros de bicarbonato- Ringer lactato tamponado que contiene 50 g / l de Dextran-40 con un peso molecular medio de 40.000 (Pharmachem) (pH ajustado a 7,4) para desplazar la sangre y facilitar una buena distribución de fijador. Este rubor de Dextrano de Ringer fue seguido inmediatamente por la perfusión de 20 litros de Trump fijador (Composición dada en la Tabla I) al que 100 ml de Se agregó la tinta china de Higgin (carbón coloidial). Perfundido Ringers-Dextran-40 tamponado y solución de Trump, (antes de la adición de la tinta china) se filtraron a través Filtros de 0,2 micrones y entregados con el mismo extracorpóreo circuito descrito anteriormente. El propósito de este control fue servir como referencia sobre nuestros técnica de fijación y preparación EM esencialmente demostrando que Fijación y microscopía en nuestras manos con tejidos de apariencia normal. descartando así el artefacto de la fijación y preparación para microscopía. El segundo animal de control fue sometido a crioprotección perfusión a 7,4 M de glicerol (concentración arterial final) por el protocolo a continuación, e inmediatamente después perfundido con 20 litros de fijador de Trump preparado en glicerol 7,0 M (también filtrado a través de un filtro de pre-bypass Pall de 0,2 micrones) con 200 ml de tinta china añadidos después de la filtración. El fijador de glicerol fue perfundido a una temperatura de 8.0 C. Inmediatamente después de la perfusión fijadora, los animales fueron secciones coronales de órganos disecadas y de 4-5 mm de espesor fueron cortados, colocados en frascos de vidrio con tapón de rosca que contienen (4 C) Fijador de Trump o Fijador de Trump que contiene 7.4M glicerol (según corresponda), refrigerado a 4 C, y transportados, como se detalla a continuación, para microscopía electrónica. El tejido del animal fijado en perfusión con glicerol se desglicerolizado a 4 C después del corte de los bloques de tejido para microscopía electrónica utilizando dos protocolos de desglicerolización: rápida y lenta. Preparación y apoyo posterior al paro cardíaco de animales criopreservados Después de la colocación de cánulas, CO y EtCO2 basales se hicieron las mediciones. El CO fue de 1.3 a 1.5 litros / min y EtCO2 fue del 5% en todos los animales. Presión arterial media (MAP) fue de 80 mmHg a 90 mmHg. El paro cardíaco fue inducido por la administración de 1 mEq / kg cloruro de potasio a través del puerto distal del Swan-Ganz catéter. El paro cardíaco ocurrió uniformemente dentro de 3-15 segundos. Se determinó un período de 5 minutos de isquemia normotérmica. luego se deja transcurrir antes de cardiopulmonar de tórax cerrado se inició el soporte técnico (CCCS) mediante el Thumper. Esofágico temperatura en el momento del paro cardíaco en los animales varió entre un mínimo de 37,4 C y un máximo de 38,2 C. Al inicio de CCCS se administraron los siguientes medicamentos a través de la periferia IV y la línea proximal del Swan-Ganz catéter con el fin de minimizar tanto la isquemia como la lesión por reperfusión por goteo. Medicamentos Epinefrina: 0,20 mg / kg administrados cada 10 minutos, presión intravenosa durante 30 minutos Nimodipina: 10 microgramos / kg seguido de 10 microgramos / kg cada 10 minutos mediante presión intravenosa lenta durante 30 minutos THAM (trometamina) 0,3 M 250 mg / kg infusión IV Deferoxamina: 500 mg de HCl por vía intravenosa Citrato de sodio: 120 mg / kg por vía intravenosa lenta Trolox: 45 mg / kg de presión intravenosa lenta Heparina: 420 UI / kg intravenosa Metilprednisolona 1 g por infusión IV Yoduro de metubina: 2 mg intravenoso Maalox, 30cc también se administró a través de la sonda gástrica y la tubo gástrico enjuagado con 20 cc de agua del grifo. Simultáneamente con el inicio de CCCS, los animales fueron cubiertos. con hielo picado y 10 galones de agua se agregaron al baño de hielo portátil. Una bomba de agua de recirculación conectada a tanto una matriz de tubos perforados (que se colocó sobre el animal) y a una manta de enfriamiento colocada debajo del animal, fue utilizado para facilitar la inducción de hipotermia a través de enfriamiento (simulado por inmersión). El protocolo para CCCS con soporte Thumper consistió en 80 compresión por minuto con una compresión a relajación ración de 50:50. Ventilación ciclada por presión, suministrada entre cada cinco compresiones torácicas con el Thumper ventilador a una presión máxima en las vías respiratorias de 30 cmH20, y un Se utilizó FiO2 del 80% en todo el CCCS. La eficacia de CCCS fue evaluado mediante la medición de CO, CO2 espiratorio final, (Nellcor Easy Cap) y pulsioximetría (usando la lengua como medida sitio) (Pulseoxímetro CSI Modelo 503). CCCS continuó durante 30 minutos antes de iniciar el soporte extracorpóreo y total lavado corporal (TBW). Los animales se colocaron en bypass cardiopulmonar de circuito cerrado. utilizando el circuito de recirculación de la perfusión crioprotectora circuito. Este circuito se cebó con aproximadamente 3 litros de una solución sanguinolenta compuesta por 1 litro de Dextrano 40 en suero fisiológico, 2 litros de Normosol-R (ph7,4) y 25 mEq de bicarbonato de sodio. Después de bomba-oxigenador-calor intercambiador de enfriamiento a aproximadamente 15 C, los animales fueron sometido a lavado corporal total (TBW) por circuito abierto Perfusión de 10 litros de perfundido MHP-2 que contiene 5% v / v glicerol. (ver la Tabla II para la composición) El extracorpóreo Luego se cerró el circuito y se añadió 65% v / v de glicerol- que contiene perfundido de MHP-2 a una velocidad de aproximadamente 400 mM / min. estaba comenzado. La perfusión crioprotectora continuó hasta el objetivo se alcanzó la concentración de glicerol. Perfundir El perfundido utilizado para la perfusión crioprotectora fue un intracelular formulación que empleó HEPES de sodio, glucosa y manitol como especies impermeables e hidroxietil almidón (HES, McGaw Pharmaceuticals, Irvine, CALIFORNIA; AV. MW 400.000 - 500.000) como coloide. los La composición del perfundido base se da en la Tabla II. El pH del perfundido se ajustó a 8.0 + o - 0.3 con hidróxido de potasio o ácido clorhídrico (rara vez se requiere) donde sea necesario. Se seleccionó un pH de 8.0 porque era considerado & quot; apropiado & quot; al grado de hipotermia experimentado durante la perfusión crioprotectora (11). Los componentes perfundidos eran de grado reactivo o USP y estaban disuelto en agua para inyección de grado USP. Perfundido fue a través de un filtro de derivación previa Pall de 0,2 micrones antes de cargar en el circuito extracorpóreo. Perfusión crioprotectora La perfusión crioprotectora de los animales se inició llevando eliminar el lavado corporal total (TBW) con el perfundido base que contiene glicerol al 5% v / v. El lavado se logró típicamente dentro de 4-6 minutos del inicio de la perfusión de circuito abierto en una tasa de flujo de 1.5 a 1.7 L / min y un promedio arterial presión (MAP) de 60 mmHg. El TBW se consideró completo cuando el hematocrito era ilegible y el efluente venoso estaba teñido de rosa o claro. Esto típicamente se logró después perfusión de 7 a 8 litros de glicerol al 5% v / v que contiene MHP- 2 perfundido. La pO2 arterial de los animales se mantuvo entre 300 mmHg y 500 mmHg en todo TBW y glicerol posterior perfusión. El pH arterial durante la perfusión crioprotectora fue entre 7,4 y 7,7 con pH arterial terminal típicamente estando entre 7,6 y 7,7. El pH venoso estaba típicamente entre 7.3 y 7.5 con pH venoso terminal entre 7.45 y 7.55 La introducción de glicerol se realizó mediante la adición de velocidad constante de perfundido base que contiene 65 v / v de glicerol a una recirculación depósito que contiene aproximadamente 15 litros de 5% v / v perfundido de base de glicerol en MHP-2. El tejido terminal objetivo La concentración de glicerol fue de 7,4 M en el efluente venoso y el objetivo curso del tiempo para la finalización de la rampa de crioprotector fue de 2 horas. los volumen de concentrado de glicerol al 65% v / v requerido para alcanzar un concentración terminal en el sistema de recirculación (y por lo tanto presumiblemente en el animal) se calculó de la siguiente manera: Vp Mc = -------- Mp Vc + Vp dónde Mc = Molaridad de glicerol en animal y circuito. Pf = Molaridad del concentrado de glicerol. Vc = Volumen del circuito y volumen intercambiable del animal. * Vp = Volumen de perfundido añadido. * Asume un volumen de agua intercambiable del 60% del peso previo a la perfusión del animal. La glicerolización de los animales se realizó a partir de un temperatura esofágica de 15 C con más o menos lineal reducción de la temperatura a medida que la concentración de glicerol fue aumentado, con la perfusión terminando típicamente a 6 C. La perfusión crioprotectora comenzó a una PAM de 40 mmHg y a una temperatura esofágica de 15 ° C. La MAP aumentó constantemente a medida que La concentración de glicerol aumentó y la MAP al final de perfusión fue típicamente entre 130 mm Hg y 160 mm Hg Tras la terminación de la rampa crioprotectora, los animales se retiraron del bypass y la cánula arterial, con un corto la longitud del tubo de PVC que se dejó conectado, se tapó con un tapón del catéter. Las cánulas venosas también se dejaron en su lugar. y conectados entre sí con un Cobe 3/8 '' Derecho conector, teniendo cuidado de excluir el aire de ambas cánulas y conector. Las cánulas se dejaron en su lugar para facilitar la pronta reperfusión al recalentamiento, los márgenes de las heridas de la ingle se aproximaron vagamente utilizando grapas quirúrgicas y el El tubo endotraqueal se tapó con un tapón de laboratorio de goma. a Evitar la entrada de medios de baño refrigerantes en los pulmones si el derrame de la bolsa de plástico durante el enfriamiento a -79C. Las sondas de termopar rectal y esofágica utilizadas para monitorizar la temperatura central durante la perfusión se aumentaron con dos sondas de termopar externas del mismo tipo para monitoreo de enfriamiento a -79 C.Una de estas sondas externas fue engrapado a la piel en la línea media del cuero cabelludo y el otro fue engrapado al abdomen, también en la línea media, aproximadamente 4 cm por debajo de la apófisis xifoides. Enfriamiento a -79 C El enfriamiento a -79 C se llevó a cabo colocando los animales dentro de una bolsa de polietileno de 6 mil de la que se evacuó el aire con una aspiradora tipo tienda y luego sumergirlos en un baño de n-propanol que se había enfriado previamente a -40 C.Animal temperaturas en el momento de la colocación en el baño de enfriamiento eran típicamente 5-6 C esofágicas, 7-9 C rectales y 8-9 C superficie. La temperatura del baño se redujo lentamente a -79 C por el adición periódica de hielo seco. Una curva de enfriamiento típica obtenido de esta manera se muestra en la Figura 4. El enfriamiento fue a una velocidad (promedio) de aproximadamente 4 C por hora. Refrigeración y almacenamiento a -90 C Después de enfriarse a -79 C, las bolsas de plástico utilizadas para proteger los animales del alcohol se limpiaron rápidamente usando toallas de tela, los animales se colocaron dentro de nailon para dormir bolsas con cierres de cordón y luego se colocaron encima tres de 6 '' x 12 '' bloques de espuma de poliestireno dentro de un Rheem Ultra de dos etapas Congelador mecánico bajo, -90 C. Refrigeración a -90 C desde -77 (criterio de valoración típico de hielo seco-alcohol) se completó en aproximadamente 6 horas. Después del enfriamiento a -90 C, los animales se mantenido a temperaturas entre -80 C y -90 C durante un período de 12 a 18 meses hasta ser retirado y recalentado para estructuras gruesas, histológicas y ultraestructurales evaluación. Se utilizó hielo seco como lastre térmico en la mecánica. congelador para proteger contra el calentamiento debido a fallas mecánicas o de energía ruptura. Recalentamiento Los animales se recalentaron a -10 C a -8 C sacándolos de -90 C en el congelador y colocarlos en un n-propanol bien revuelto baño que se había enfriado previamente a 0 C. Temperatura del baño típicamente declinó a aproximadamente -15 C y subió lentamente hacia 0 C. Cuando la temperatura del baño alcanzó los 0 C se mantuvo a 0 C + o - 3 C mediante la adición de hielo seco a el baño de alcohol hasta que la temperatura central del animal alcance -10 C. El recalentamiento fue a una tasa promedio de 10 C por hora para -10 C en cuyo punto no se pudo detectar hielo en los tejidos por palpación externa. Una curva de recalentamiento típica se muestra en Figura 5. Cuando las temperaturas centrales de los animales alcanzaron los -6 C, estaban del baño de alcohol, las bolsas de plástico de 6 mil retirado, y los animales se colocaron encima de una cama de Zip-Loc bolsas de plástico llenas de hielo picado y cubiertas con hielo triturado que contiene bolsas Zip-Loc en la sala de operaciones mesa. Los animales se volvieron a conectar a un simplificado Circuito extracorpóreo para perfusión de fijador. los El catéter de monitorización de la presión arterial también se volvió a conectar a al transductor de presión para permitir el control de la presión durante la perfusión fijadora. Nota: se encontró una gran dificultad para medir la perfusión presión en los dos primeros animales debido a la falta de lavado de la líneas de control con 7,4 M de glicerol antes de la congelación. los En cambio, las líneas se llenaron con solución salina del sistema Intraflow. utilizado para prevenir la coagulación antes de la heparinización de la animal (3 cc de solución salina normal por hora que fluye a través del catéter). Dado que la mayor longitud del catéter fue profundamente dentro del animal, y la temperatura central del animal estaba muy por debajo del punto de congelación de la solución salina, requirió gran ingenio para liberar el lumen de la presión monitorear catéteres de hielo; esto finalmente fue logrado por haciendo avanzar lentamente un alambre de cobre calentado a través del catéter. Fijación Después de colocar en la mesa de operaciones una incisión en la línea media se hizo desde la muesca esternal hasta la sínfisis del pubis. los el tórax se abrió mediante una esternotomía media y el abdomen a través de una laparotomía medio ventral. El torácico y abdominal las incisiones se retrajeron para permitir la visualización de la vísceras cuando comenzó la perfusión fijadora (Figura 6). Cuando la temperatura central (esofágica) alcanzó -6 C de perfusión se inició la perfusión fijadora. Fijador preenfriado (1-2 C) se entregó a una temperatura de 4 C utilizando un circuito abierto que consta de una bomba de rodillos, una bomba de calor pediátrica Gish intercambiador, y un filtro Pall 1440 de 40 micrones. El retorno venoso fue a través de la cánula venosa femoral a la que se adjuntó un (imprimado) 3/8 '' Conector en Y y varios pies de 3/8 '' x3 / 32 '' línea que se dejó escurrir en un balde cubierto con 1 '' de aceite de maíz en el fondo (para minimizar la exposición del personal a formalina). Aproximadamente 15-20 litros de almacenamiento de Trump fijador que contiene 7,0 M de glicerol (al que 100 ml de India Se añadió tinta) luego se perfundió en circuito abierto. Después de la perfusión fijadora, el animal fue inmediatamente disecados y muestras de corazón, pulmón, hígado, páncreas, bazo, riñón y músculo esquelético fueron recolectados para posterior examen histológico y ultraestructural. Las muestras de estos órganos se sumergieron inmediatamente en refrigerado glicerol que contiene el fijador de Trump. Todos los órganos fueron Multiplique seccionado tanto sagital como coronalmente para evaluar el grado de reperfusión, como lo indica la distribución de Tinta china. Luego, el cerebro se retiró en bloque a un matraz que contenía 300 400 ml de fijador con glicerol 7M (suficiente para cubrir el cerebro completamente). El cerebro fue removido momentáneamente de este baño fijador y cada hemisferio fue seccionado (incompleta) tanto coronal como sagitalmente para evaluar distribución de fijador / tinta y la integridad del lecho capilar. Luego, el cerebro se devolvió al glicerol. que contiene fijador y refrigerado durante la noche antes de la corte de secciones para microscopía. Al día siguiente, secciones coronales del cerebro izquierdo. hemisferio al nivel del hipocampo de diferentes de espesor (de 5 mm a 1 mm) se cortaron, se colocaron en fresco glicerol que contiene Trump y enviado en hielo a un académico facilidad de procesamiento por un electrón profesional microscopista utilizando técnicas estándar. Antes de lo normal procedimientos preparativos para EM el tejido fue sometido a múltiples lavados con el fijador de Trump que contiene concentraciones progresivamente más bajas de glicerol durante un período de aproximadamente 1 semana hasta que se eliminó todo el glicerol. Durante preparación final de la muestra para microscopía electrónica, se tomado para evitar el uso de los bordes cortados de las secciones de tejido en preparación de las secciones incrustadas de Epon. Desglicerolización de muestras Como se señaló anteriormente, para evitar el choque osmótico, todos los tejidos Las muestras fueron inicialmente perfundidas y sumergidas en el fijador que contiene glicerol 7 M y posteriormente desglicerolizado antes de teñir e incrustar por pasos incubación en Trump que contiene concentraciones decrecientes de glicerol. La necesidad de utilizar este enfoque en presumiblemente bien fijado y, por tanto, presumiblemente osmóticamente "desensibilizado" los tejidos pueden parecer sin base. Sin embargo, tanto nosotros como otros investigadores han encontrado un efecto perjudicial significativo de simplemente sumergir tejido fijo cargado con multimolar concentraciones de glicerol en glicerol libre (y por lo tanto por comparación muy hipoosmolar) fijador (12). III EFECTOS DEL SOPORTE CARDIOPULMONAR PECHO CERRADO Al comienzo del soporte de Thumper, el MAP estaba entre 25 mmHg y 30 mmHg y aumentó a entre 35 mmHg y 45 mmHg con el administración de un bolo inicial de dosis alta (0,2 mg / kg) epinefrina. El CO2 espiratorio final en este momento era de 1-2% y cardíaco la producción fue de 0,5 a 0,7 litros por minuto (LPM). Después de los 30 minutos de CCCS, MAP había disminuido de 30 mmHg a 35 mmHg con un correspondiente disminución en la capacidad de respuesta a cada bolo de epinefrina. El CO2 espiratorio final disminuyó del 1% al 0,5% y el CO disminuyó a 0,3 a 0,5 LPM. La temperatura esofágica a la final de CCCS e inmediatamente antes del inicio de la derivación disminuyó a 21 a 28 C dependiendo de la masa del animal y la cantidad de grasa subcutánea que cubre al animal (la grasa subcutánea sirvió como un buen aislante y en gran medida enfriamiento lento, algo independiente de la masa corporal total). IV. EFECTOS DE LA GLICEROLIZACIÓN El lavado de sangre fue rápido y completo en todos los animales. MAPA aumentó bruscamente a medida que aumentaba la concentración de glicerol, probablemente como resultado de la viscosidad creciente del perfundido como es mostrado en la Figura 7. Aproximadamente 5 minutos después del comienzo del rampa crioprotectora, se observó flacidez ocular bilateral. A medida que avanzaba la perfusión, la flacidez ocular progresaba hasta que los ojos hubieran perdido aproximadamente del 30% al 50% de su volumen. El examen macroscópico de los ojos reveló que La pérdida de agua se debió principalmente al humor acuoso, con más pérdidas significativas de la cámara posterior de los ojos aparentemente no ocurre hasta más tarde en el curso de perfusión. Dentro de los 15 minutos posteriores al inicio de la glicerolización la superficie de la córnea se volvió irregular e irregular y los ojos había desarrollado una apariencia cóncava. La deshidratación también fue evidente en la piel y el esqueleto. músculos y se evidenció por una marcada disminución en la circunferencia de las extremidades, profunda rigidez muscular, arrugas cutáneas, un `` ceroso- correoso & quot; textura y una apariencia momificada de ambos cortes piel y músculo esquelético. Evaluaciones de agua tisular realizadas en íleon, riñón, hígado, pulmón y músculo esquelético confirmado las observaciones brutas. Las observaciones preliminares sugieren que la pérdida de agua estaba en el rango de 30% a 40% en la mayoría tejidos como se observó previamente tanto en animales anteriores estudios (5,6) y en humanos sometidos a criopreservación utilizando un protocolo similar. (13) Examen de los hemisferios cerebrales en la craneotomía reveló una reducción estimada del 30% al 50% en el cerebro volumen, presumiblemente como resultado de la deshidratación osmótica secundaria a la glicerolización. Las cortezas también tenían la & quot; ceroso & quot; Apariencia ámbar previamente observada como característica. de cerebros glicerolizados. El aspecto macroscópico de los riñones, bazo, mesentérico y grasa subcutánea, páncreas y órganos reproductivos (donde presente) eran normales. Aparecieron íleon y mesenterio. algo deshidratado, pero no exhibió la densa aspecto momificado / ceroso que era característico del músculo, piel y cerebro. Consumo de oxígeno (determinado midiendo el diferencia arterial / venosa) durante la perfusión fue bastante constante a aproximadamente 3 M de glicerol y luego cayó bruscamente como Se acercó a una concentración de glicerol 6 M (la alta viscosidad del perfundido por encima de 6M realizado por el Nova Stat 5 Perfil del sistema de electrolitos y gases en sangre utilizado en estos experimentos imposibles. Consumo de oxígeno versus glicerol La concentración se muestra en la Figura 8. pH arterial y venoso, La PO2, la PCO2 y los electrolitos se muestran en las Figuras 9, 10, 11, y 12 respectivamente. IV. EFECTOS BRUTOS DE ENFRIAR Y RECALENTAR DESDE -90 C La apariencia macroscópica de la piel de los animales, torácica y las vísceras abdominales fueron sorprendentemente buenas (Figura 13). En contraste con las sutiles alteraciones posteriores al deshielo en la apariencia de los tejidos de animales criopreservados en nuestro anterior estudios, los colores de los tejidos eran "normales"; es decir, normal para órganos y tejidos sometidos a TBW con MHP-2 (un sobreviviente procedimiento). Particularmente ausente fue el observado anteriormente (14, 15) textura alterada de los tejidos después de la descongelación, sin pulpa material de recubrimiento de guantes o instrumentos al seccionar. También en en contraste con la evaluación previa posterior a la criopreservación de ambos humanos (14) y animales, la vasculatura contenía perfundido en cantidades notables después de la descongelación y el & quot; tiempo de llenado & quot; requerido para lograr el retorno venoso fue mucho más corto. Quizás lo más sorprendente fue la excelente reperfusión de prácticamente todos los sistemas de órganos de los animales (Figuras 13, 14, 15) con la excepción del bazo (Figura 16), que no pudo perfundir casi por completo. Distribución de carbono fue uniforme, se produjo rápida y uniformemente después del inicio de la perfusión y el retorno venoso fue excelente. De hecho, MAP cayó de manera constante durante los primeros 5-10 minutos de reperfusión de 140 mmHg a 80 mmHg a 90 mm Hg, antes de comenzar a subir, presumiblemente cuando la fijación tuvo lugar haciendo que los capilares tanto rígido como libremente permeable al coloide. Flujo fijador las velocidades estaban en el rango de 800 cc / min a 1,2 LPM. En dos de los animales, un área de perfusión fallida obvia ocurrió (Figura 17) en la parte dependiente del estómago como evidenciado por la apariencia rosa blanquecina normal de una isla de tejido en contraste con el negro uniforme del áreas reperfundidas. Al abrir el estómago se descubrió que el líquido / contenido del estómago estaba parcialmente congelado sobre el área de reperfusión fallida. La explicación lógica de esto es que la dilución del crioprotector concentración en la pared del estómago que subyace al contenido del estómago, por difusión de agua del contenido del estómago durante el largo El tiempo de enfriamiento redujo la concentración de glicerol en los tejidos. a un nivel lo suficientemente bajo como para comprometer la integridad vascular. Presumiblemente, tal dilución habría resultado en más hielo. formación en el tejido afectado y, por tanto, mayor criolesión con posterior compromiso del lecho capilar. La cámara del ventrículo izquierdo que está secuestrada detrás Se encontró uniformemente que la válvula aórtica contenía hielo grande cristales en una masa fangosa (Figura 18) con fallas asociadas perfusión del endocardio (de nuevo, presumiblemente como resultado de dilución de crioprotector por debajo del umbral requerido para proporcionar protección capilar). Este hielo ventricular izquierdo se observó que tenía un tinte rosado fuerte y muchos glóbulos rojos Se observaron fantasmas cuando el hielo se derritió y se examinó. bajo el microscopio óptico. Quizás lo más importante es que no hubo evidencia de agrietamiento o fracturamiento, a pesar de que estos animales se enfriaron a cerca de Tg para soluciones de agua con glicerol y recalentado por transferencia desde -90 C a 0 C en un baño líquido creando una gran superficie hasta el núcleo diferencial térmico. Para explorar la fragilidad y ductilidad de animales cargados con 7,4 M de glicerol y enfriados a -90 un animal fue cargado con 30 kilos de hielo seco colocado cruzando el tórax y el abdomen con el animal suspendido (cabeza y cuartos traseros) sobre dos bloques de espuma de poliestireno (sin apoyos entre). Esta carga estática se mantuvo durante 48 horas a -90 C sin evidencia de flacidez, flexión o agrietamiento en el grosor, histológico o Niveles ultraestructurales. Particularmente sorprendente fue la perfusión fijadora uniforme de la cerebro. (Figuras 19, 20, 21) Una ventaja de las partículas de carbono marcador sobre tinte es que es posible demostrar que no sólo llenado de grandes vasos, pero de perfusión del capilares también, como lo demuestra el oscurecimiento uniforme de la tejido a negro o gris carbón. Un inconveniente de los tintes es que se difunden rápidamente fuera de los vasos hacia áreas de fallas perfusión. Partículas sólidas de carbono (1-2 micrones en diámetro) no pueden hacer esto y por lo tanto permanecer donde están depositado durante la perfusión (14). IV. EFECTOS DE LA CRIOPRESERVACIÓN SOBRE LA ULTRASTRUCTURA CEREBRAL En marcado contraste con todos los estudios citados anteriormente, el alto grado de conservación ultraestructural observado en esta serie de animales no tiene precedentes. Para mejorar caracterizar tanto el grado de conservación como el grado de lesión, la discusión de estas dos facetas de los resultados se manejarán en secciones separadas, comenzando con un descripción general de la lesión / alteraciones en el tejido cerebral ultraestructura que se observaron. Lesión y alteraciones de la ultraestructura Básicamente hay cuatro clases de lesiones o alteraciones en aparición de ultraestructura observada en estos animales: primero son los cambios observados en ambos glicerolizados-fijados (pero no congelados) y los observados en animales que fueron sometido a glicerolización, congelación, descongelación y fijación. En ambos grupos de animales hay cambios característicos en la densidad del citoplasma y la sustancia fundamental que asociar con la deshidratación; hay paquetes de & quot; apilados & quot; ribosomas que ocupan grandes fracciones del citoplasma (Figura 22), pequeñas mitocondrias con densas crestas (Figura 23), y nucléolos encogidos. (Figura 24) La densidad del suelo sustancia parece mejorada en ambos grupos, y algunos no las células neuronales (posiblemente astrocitos) parecen haber perdido integridad de la membrana plasmática y aparecen como núcleos desnudos Rodeado de restos vesiculares (Figura 24). También hay alteraciones en la densidad nuclear en ambos grupos. sugerente de pérdida o redistribución de energía nuclear material. Las membranas nucleares aparecen nítidas e intactas en ambos grupos, por lo que es difícil sacar conclusiones de esta. Tanto en glicerolizado gris congelado como no congelado y materia blanca hay un modesto aumento en el intercelular espacio (Figura 25, 26) en comparación con el no glicerolizado control perfundido con un corazón latiendo (Figura 27). Estas Los aumentos en el espacio intercelular probablemente también sean un resultado de la deshidratación secundaria a la glicerolización. Finalmente, al menos otros cinco cambios que ambos grupos tienen en comunes en comparación con el control fijo del corazón latiendo son parciales Desmoronamiento de la mielina, (Figura 28, 29) contracción del axoplasma dentro de la mielina, deshidratación de las mitocondrias y nucleolos, la presencia de escombros ocasionales esparcidos & quot; lágrimas & quot; en el tejido (Figura 30, 31) y mayor dificultad para discernir el plasma membranas. Estas lágrimas son muy infrecuentes en el glicerolizado. controles no congelados y más común en los controles congelados-descongelados; aunque todavía ocurren con poca frecuencia en el congelado-descongelado grupo también. Además, la etiología de estas lágrimas parece diferente entre los dos grupos; en los grupos de congelados descongelados fisuras o desgarros están relativamente bien definidos, los espacios contienen escombros mínimos y los bordes parecen complementarios, como dos mitades de un trozo de papel roto. Quizás el grado de & quot; coincidencia & quot; entre los lados de estas fisuras podría caracterizarse mejor por el grado de & quot; coincidencia & quot; observado en fotografías orbitales de continentes que experimentan millones de años de deriva continental; que los patrones están relacionados es obvio, pero la coincidencia no es precisa. Las fisuras observadas en el tejido no congelado glicerolizado (tanto la materia gris como la blanca) parecen menos limpias y más escombros esparcidos. La etiología de estas lágrimas sigue siendo más un misterio. Lesiones observadas de forma exclusiva o más extensa en el Los cerebros congelados-descongelados son los siguientes: a) Áreas de gran aumento (40.000 x) donde la mielina parece haber perdido su estructura laminar y presenta una apariencia amorfa o desintegrada, como una tosca el dibujo de carboncillo de anillos fuertemente concéntricos había sido manchado o manchado (Figura 31). b) Pérdida o alteración del nucleoplasma que es evidente en ambos baja maginificación (6700x) y mayores aumentos (40.000x). Este cambio no se observa de manera uniforme en todos núcleos, pero es muy común (Figura 32). c) Agujeros o espacios pericapilares (Figura 33) ocasionalmente esparcidos por vesículas o escombros (Figuras 34, 35) todavía están presente; Estos se han observado en trabajos previos con gatos. y conejos y su ubicación y apariencia se correlacionan bien con la presencia observada de hielo en gris sustituido por congelación y materia blanca (Figuras 36, 37). Sin embargo, debería ser señaló que estos & quot; agujeros de hielo & quot; ocurren con mucha menos frecuencia en los 7,4 M de cerebros glicerolizados de lo que se ha observado en los cerebros criopreservados con glicerol 3 M (o concentraciones más bajas) (Figuras 38,39). Preservación de la ultraestructura La diferencia más llamativa entre este trabajo y el anterior estudios de criopreservación cerebral es la reconocibilidad general, inferrabilidad e incluso & quot; normalidad & quot; que está presente en las micrografías. (Figuras 40, 41, 42) Examen de neuropil, sinapsis individuales y axones con aumentos de 40.000x a 80.000x revelan una excelente preservación de la estructura fina (Figuras 43, 44, 45). Sinapsis la morfología es normal en apariencia y vesículas sinápticas, membrana estructura y apariencia general son casi indistinguibles de control no glicerolizado, no congelado, (Figura 46) y son virtualmente indistinguible de los controles no congelados fijados con glicerol (Figura 47). La relación de las neuronas entre sí y de los procesos finos como las espinas dendríticas parecen muy bien conservados con excepción de los ocasionales desgarros o fisuras de 5-10 micrones. La integridad capilar es excelente con células endoteliales intactas membranas, célula intraendotelial claramente visible ultraestructura y membranas basales intactas. Capilar los lúmenes son claros o muestran ocasionalmente negro oscuro partículas de carbono (Figura 48). Muy raramente, pequeño vesículas o trozos de material de la membrana muy por debajo de 0,2 micrones de diámetro se puede observar en el lumen del capilar adyacente a una célula endotelial (Figura 49). Lavado de sangre parece estar completo ya que no hay glóbulos rojos u otros elementos formados de la sangre presente en los capilares en cualquier micrografía. Orgánulos intracelulares mientras están algo deshidratados en la apariencia es fácilmente identificable; el endoplásmico retículo, mitocondrias, aparato de Golgi, lisosomas y el La fina estructura del axoplasma está bien conservada. Las mitocondrias rara vez están hinchadas, muestran (deshidratadas, comprimidos) crestas, y están ausentes de cristales de calcio. Del mismo modo, los polirribosomas parecen normales en arquitectura. y no están disociados. RESUMEN Creemos que este estudio demuestra, por primera vez, preservación de la ultraestructura cerebral con suficiente detalle para proporcionar, de manera calificada, una base probatoria para reconstrucción de humanos criopreservados utilizando la información- criterio teórico (15). Sin una comprensión completa de cómo la memoria, la personalidad y la identidad están codificadas en el ser humano cerebro no es posible afirmar con certeza que estos funciones se conservan, incluso con el comparativamente buena conservación ultraestructural reportada aquí, y esto sigue siendo el principal & quot; calificador & quot; sobre el optimismo expresado encima. Si bien hay muchos elementos ultraestructurales e histológicos preservación en evidencia en las micrografías obtenidas en este serie, también hay evidencia de daños considerables. Particularmente preocupante es la presencia continua de grandes (5 a 15 micrones de diámetro en sección transversal) lágrimas de desconocido & quot; profundidad & quot; tanto en la materia gris como en la blanca. Deshidratación de estructuras y la presencia de lo que parecen ser núcleos libres y las células gliales lisadas también son perturbadoras. Otra advertencia importante a considerar en el contexto de la Los resultados comparativamente positivos demostrados en este estudio son el pre-mortem relativamente benigno (es decir, antes del paro cardíaco) y el insulto posterior al paro cardíaco de que estos animales expuesto a. La isquemia noromérmica completa fue breve y en el margen de la reversibilidad clínica contemporánea. El cargo arresto Thumper soporte (incluso con el uso de dosis altas epinefrina) fue extremadamente inadecuada, como lo indica el bajo nivel de CO, EtCO2 aMAP y SaO2. Este período de goteo debido a la La falla de CCCS para administrar CO adecuado fue breve en comparación con el curso típico de los pacientes con criónica clínica. En un mínimo, este estudio confirma la pobreza de circulación apoyo proporcionado por cardiopulmonar de tórax cerrado reanimación y se puede suponer con certeza que fue sólo la brevedad poco realista de este período de inadecuada circulación y ventilación que impidieron aún más que ocurra una lesión isquémica. Claramente, más efectivo Se necesitan medios de apoyo circulatorio para cerrar la brecha. entre pronunciamiento (paro cardíaco) y acceso vascular y el inicio del soporte circulatorio extracorpóreo. Por lo tanto, aunque este estudio demuestra una preservación sustancial de la ultraestructura e histología del cerebro, también señala Queda mucho por hacer antes de que el cerebro reversible se puede lograr la criopreservación o puede haber un alto grado de confianza en que las estructuras responsables de la memoria y la personalidad permanecen lo suficientemente intactas para permitir recuperación de pacientes criopreservados en una escala de tiempo razonable (50 a 150 años). TABLA I. Composición del fijador de almacenamiento de Trump Componente g / l Paraformaldehído 40 g Glutaraldehído al 50% 20 ml Hidróxido de sodio 2 7g Fosfato de sodio dibásico .H2O 11,6 g Agua destilada 980 ml pH ajustado a 7,4 con hidróxido de sodio. _________________________________________ TABLA II Composición perfundida FÓRMULA PARA BASE MHP-2 PERFUSAR Componente Concentración molar Gramos / Litro Gramos / 20 Litros mM Manitol 170,0 (PM 182,20) 30,97 619,40 Adenina HCl 0,94 (PM 180,6) 0,17 3,4 D-Ribosa 0,94 (MW 150,2) 0,14 2,82 Bicarbonato de sodio 10,00 (PM 84,0) 0,84 16,8 Cloruro de potasio 28,3 (PM 74,56) 2,11 42,2 Cloruro de calcio Solución al 10% (p / v). 1 (PM 111) 0,28 ml 5,6 ml Cloruro de magnesio 20% (p / v) soln. 1 (PM 95,2) 1,0 ml 20,0 ml Sodio HEPES 15 (MW 260,3) 3,90 78,0 Glutatión (ácido libre) 3 (PM 307,3) 0,92 18,44 Almidón de hidroxietilo ---- 50,00 1.000,00 Glucosa 5 (PM 180,2) 1,80 36,0 Heparina ---- 1,000 UI 20,000 UI Insulina (Humulina U-100) 40 UI 800 UI </PRE>
