Informe de investigación de CI: 2007

 

por Yuri Pichugin, PhD, Criobiólogo del personal, Cryonics Institute

Pude realizar 160 experimentos este año. Los experimentos se dedicaron a tres proyectos de investigación principales.

1. Compuestos que pueden mejorar los resultados de la isquemia a largo plazo.

Los compuestos habituales que se utilizan contra la isquemia a corto plazo (es decir, antioxidantes) no podrían funcionar contra el almacenamiento en frío del cerebro a largo plazo (12-36 horas). Decidí probar algunos compuestos inusuales.

Existe un método de conservación de trozos de vasos sanguíneos con bajas concentraciones de formaldehído. Probé tres compuestos de la clase química de los aldehídos para verificar la posibilidad de la llamada anabiosis química. Los aldehídos que probé fueron formaldehído, acetaldehído y glutaraldehído. Usé concentraciones muy bajas y no tóxicas de estos compuestos.

Una pregunta de este estudio fue ¿podrían los aldehídos modificar de manera reversible las estructuras celulares finas para que la célula se vuelva más resistente a la isquemia fría a largo plazo? ¿Podrían los aldehídos "unirse", "arreglar" de manera reversible los eslabones débiles en las estructuras celulares moleculares que están sujetas a los efectos dañinos del frío a largo plazo?

Las partes superiores de las ratas se perfundieron con diversas concentraciones no tóxicas de aldehídos a 0ºC y se almacenaron durante 24 horas a 0ºC. La supervivencia del cerebro se evaluó mediante el método habitual de corte de hipocampo que realicé. No se encontró ningún efecto positivo de los aldehídos.

2. Otro proyecto fue el estudio de los bloqueadores de hielo 12CM .

El 21CM emplea bloqueadores de hielo al 1% X-1000 y% Z-1000 en sus VM.

Supongo que las velocidades de enfriamiento y calentamiento de los pacientes son de 0,3º / min. Encontré que la concentración mínima (crítica) de CI-VM-1 requerida para vitrificar un volumen de 20 ml sin los bloqueadores de hielo era del 55% en enfriamiento a -130ºC (y recalentamiento) a 0.3º / minuto. 52% CI-VM-1 sin bloqueadores de hielo da como resultado cristales de hielo. Fue 52% CI-VM-1 con los bloqueadores de hielo. 50% CI-VM-1 con los bloqueadores de hielo da como resultado cristales de hielo

Los resultados de la prueba de toxicidad fueron los siguientes:

86,1% de viabilidad ± 5,8% para una concentración de 55% CI-VM-1 sin bloqueadores de hielo

Viabilidad del 89,6% ± 6,2% para una concentración de CI-VM-1 al 52% con bloqueadores de hielo

El ensayo de toxicidad se realizó utilizando proporciones de potasio / sodio.

Mis experimentos con los bloqueadores de 21CM mostraron que los bloqueadores pueden disminuir la concentración efectiva de CI-VM-1 requerida para la supervivencia en aproximadamente un 3%. Los bloqueadores de hielo pueden ser valiosos para la criopreservación de órganos, pero no son tan importantes para la criónica.

Hay muchos más factores dañinos para los pacientes criónicos que el insignificante aumento de la toxicidad debido a un aumento del 3% en la concentración de mezclas de vitrificación. Ni siquiera tomo en cuenta la permeación de los bloqueadores a través de la barrera hematoencefálica y las membranas celulares. Para conseguir el mismo efecto, podemos utilizar un 3% más de CI-VM-1 en lugar de un 3% de bloqueadores de hielo (lo que sería mucho más caro).

3. Un importante proyecto de investigación que realicé fue un método de vitrificación para pacientes que no han experimentado tiempos de isquemia prolongados.

La isquemia fría de 12-24 horas redujo la supervivencia de los tejidos cerebrales al 40% del control. Debemos crear para los miembros de CI un método mejorado de vitrificación de CI con la mejor criopreservación posible de los tejidos cerebrales. Para esto, en primer lugar, los pacientes potenciales con IC deben evitar largos tiempos de isquemia organizando un equipo de reserva y mudándose a Michigan cuando se encuentren en una condición terminal.

Un problema más significativo de la criopreservación de cerebros completos es su deshidratación severa durante la perfusión VM. Todos los agentes crioprotectores (CPA) tienen tasas de penetración mucho más lentas a través de la barrera hematoencefálica intacta que el agua. El agua sale del cerebro mucho más rápidamente de lo que los CPA ingresan al cerebro durante la perfusión de CPA. Como resultado, se produjo una deshidratación grave del cerebro durante la perfusión. La deshidratación severa es un factor muy dañino porque aumenta dramáticamente la toxicidad del CPA. Los CPA penetran en finas rodajas cerebrales por simple difusión, por lo que las rodajas no tienen deshidratación grave.

Como ejemplo del gran beneficio que puede obtenerse mediante el uso de la sustancia X, el etilenglicol (EG) al 30% no es tóxico para los tejidos cerebrales en determinadas condiciones. Los cortes de hipocampo de rata que se expusieron a EG al 30% a 0ºC tuvieron una supervivencia del 100% según el ensayo de relación K / Na. Los cerebros de rata que fueron perfundidos con 30% de EG a 0ºC sin la Sustancia X solo tuvieron alrededor del 40% de supervivencia. Los cerebros tenían aproximadamente un 35% de deshidratación. Cuando modifiqué la BBB de rata con Sustancia X, los cerebros retuvieron sus volúmenes normales durante la perfusión. Como resultado, los cerebros de rata que fueron perfundidos con 30% de EG a 0ºC con la concentración adecuada de Sustancia X tuvieron un 100% de supervivencia.

La tarea principal del proyecto fue modificar la BBB para que el cerebro mantenga su volumen normal durante la perfusión de VM. Estudié doce compuestos de las cuatro subclases químicas de la clase a la que pertenece la Sustancia X. Cuatro de los doce compuestos mostraron una buena actividad deseable. Los describo como modificadores de la barrera hematoencefálica o modificadores BBB.

Probé los mejores modificadores en cerebros de ovejas. Los cerebros de las ovejas retuvieron el volumen del cerebro durante la perfusión VM, así como lo habían hecho los cerebros de las ratas. Se seleccionó el mejor de los cuatro buenos modificadores para el nuevo método de criopreservación de IC para pacientes que no han experimentado largos períodos de isquemia.

No tiene sentido usar modificadores de BBB para quienes han experimentado largos períodos de isquemia porque la isquemia destruye la BBB para que el cerebro no tenga una deshidratación severa. Determiné los límites de duración de la isquemia fría para el uso óptimo de los modificadores BBB. Se debe utilizar la concentración completa del mejor modificador BBB para la perfusión VM de cerebros de rata y oveja hasta la isquemia fría de 9 horas. Debemos utilizar sólo la mitad de la concentración del modificador entre 9 horas de isquemia fría y 18 horas de isquemia fría. No debemos utilizar ningún modificador BBB para la perfusión de VM del cerebro después de 18 horas de isquemia fría porque pueden causar edema tisular.

Todos los métodos de criopreservación conocidos dan como resultado una supervivencia muy pobre de las células cerebrales de cerebros completos después de su criopreservación. Este nuevo método de CI aumenta significativamente la supervivencia de las células cerebrales. El uso adecuado del método puede preservar aproximadamente el 80% de las células después de la criopreservación de cerebros completos. CI presentó una solicitud de patente provisional para el método.

Informe de investigación de CI: 2006

 

por Yuri Pichugin, PhD, Criobiólogo del personal, Cryonics Institute

Pude realizar 140 experimentos este año. Los experimentos se dedicaron a varios proyectos de investigación.

1. Continué estudiando la posibilidad de preservar el cerebro de los pacientes durante el transporte de 12 a 24 horas desde regiones que están lejos de CI.

1.1 Terminé el estudio de la isquemia fría y caliente del cerebro de rata. Los resultados fueron publicados en la revista Immortalist (2006, vol. 38, No. 1-2 y 5-6). La conclusión principal es que ninguna de las soluciones y aditivos actuales para la conservación de órganos fueron útiles para el almacenamiento en frío del cerebro a largo plazo. La criónica es muy diferente de la criobiología y la medicina actuales porque se basa en la tecnología perfecta del futuro, pero la criobiología y la medicina imperfectas de hoy solo pueden utilizar recursos naturales y espontáneos de los sistemas biológicos para recuperarlos del daño isquémico.

1.2 Continué estudiando los experimentos del Dr. Suda utilizando cerebros de rata completos y el ensayo de relación K / Na. Los cerebros se perfundieron con soluciones de glicerol (5, 10 y 15% v / v) a 0ºC, se enfriaron lentamente a -20ºC, se mantuvieron a esta temperatura durante 12-24 horas y se lavaron con glicerol. La supervivencia de los tejidos cerebrales de la rata se evaluó mediante el método de corte del hipocampo que usualmente usé. Los tejidos estaban muertos.

1.3 Continué estudiando los experimentos del Dr. Seki usando tejidos cerebrales de rata. El Dr. Seki deshidrató corazones de rata hasta cierto punto y los mantuvo en un medio no acuoso. ¡Él informó brevemente en la revista Cryobiology en 1999 que pudo preservar y resucitar los corazones de rata después de un almacenamiento en frío de 10 a 26 días! Sin embargo, no hubo ninguno de sus artículos o solicitudes de patente sobre este tema para 2000-2006.

Intenté utilizar soluciones de glucosa al 2,5-20% para deshidratar el cerebro de las ratas en varios grados para mejorar el almacenamiento en frío de los cerebros. Sin embargo, esa deshidratación osmótica fue perjudicial para el cerebro de las ratas.

También intenté usar el procedimiento del Dr. Seki para hipocampo de rata. Los hipocampos se almacenaron en líquido inerte con gel de sílice a 2-4ºC durante 24 horas. No hubo ningún efecto positivo.

Se secaron hipocampo de rata con gel de sílice en viales de 20 ml sin líquido inerte a 2-4ºC durante varios tiempos y posterior almacenamiento en frío de los hipocampos durante 24 horas. Los experimentos se realizaron para encontrar la influencia de varios grados de deshidratación de hipocampo de rata por secado sobre la supervivencia de las rodajas. De nuevo no hubo ningún efecto positivo.

Me gustaría publicar los resultados de mis experimentos sobre los sujetos del Dr. Suda y del Dr. Seki en la revista Immortalist.

2. Continué estudiando la calidad de la perfusión de la mezcla de vitrificación (VM) para cerebros de ovejas que tenían isquemia fría de 24 horas.

Es una investigación importante para la IC porque la mayoría de los pacientes con IC tenían isquemia fría a largo plazo (12-24 horas). Mis experimentos demostraron que las cabezas de oveja se perfundieron con éxito con soluciones VM-1 incluso después de su almacenamiento a 2-4ºC durante 24 horas. Los cerebros de las ovejas tenían la vitrificación estable. Es un resultado positivo muy importante para nosotros. Tampoco observé ninguna rotura de los vasos sanguíneos cerebrales.

3. Estudié algunos problemas de la perfusión VM del cuerpo. La saturación del cuerpo humano con cualquier mezcla de vitrificación requiere una gran cantidad de VM para obtener su vitrificación uniforme y estable.

Un problema principal fue la acumulación de una gran cantidad de perfundidos en el tracto digestivo y la cavidad abdominal. Se desconoce la causa exacta de este fenómeno. Lo más probable es que haya una fuga de capilares sanguíneos en esas regiones. Por ahora, es imposible saturar el cuerpo de un paciente con mezclas de vitrificación para obtener su vitrificación uniforme y estable.

En el pasado, CI tenía un poco de hinchazón en el abdomen de los pacientes porque CI usaba una cantidad muy pequeña de soluciones de glicerol para la perfusión corporal. A veces, la IC tenía una hinchazón mayor incluso con la pequeña cantidad de soluciones de glicerol porque esos pacientes con IC tenían cáncer de órganos internos.

Elaboré un método de perfusión del cuerpo de un paciente con soluciones de etilenglicol (EG) para el procedimiento de congelación, pero no para el de vitrificación. Las soluciones de EG concentradas son mucho menos viscosas que las de glicerol. EG penetra mejor en los tejidos que el glicerol.

4. He escrito una solicitud de patente para el método CI de criopreservación de tejidos cerebrales por vitrificación.

Necesitaba realizar varios experimentos adicionales para la aplicación. La mezcla de vitrificación del Cryonics Institute (CI-VM-1) es muy simple y barata. Esta es una de las ventajas más importantes de CI-VM-1 en comparación con otras máquinas virtuales conocidas.

5. Continué estudiando la posibilidad de una mejora del método de vitrificación de IC actual para pacientes potenciales de IC sin isquemia a largo plazo.

La isquemia fría de 12-24 horas redujo la supervivencia de los tejidos cerebrales al 40% del control. Deberíamos proponer a los miembros de CI un método mejorado de vitrificación de CI con la máxima criopreservación posible de los tejidos cerebrales. Para ello, en primer lugar, los pacientes potenciales con IC deben evitar la isquemia a largo plazo.

Creo que los compuestos habituales que se usaron contra la isquemia a corto plazo (es decir, antioxidantes) no pueden mejorar el almacenamiento en frío del cerebro a largo plazo (12-36 horas). Decidí probar algunos compuestos inusuales. Pero tengo una pequeña esperanza de mejorar los resultados de la isquemia a largo plazo.

Uno de los factores dañinos es la deshidratación excesiva del cerebro durante la perfusión VM. La causa de este problema es una permeabilidad muy baja de la barrera hematoencefálica (BBB) ​​para los agentes crioprotectores. Como informé anteriormente, pude saturar los cerebros de ratas y ovejas con VM-1 completamente sin deshidratación usando la Sustancia X para abrir BBB. Sin embargo, necesito continuar con el estudio de la influencia de la deshidratación cerebral en la supervivencia del tejido cerebral para encontrar un procedimiento óptimo para abrir BBB. El procedimiento podría ser material para una nueva solicitud de patente.

La saturación del cerebro humano con un 70% de VM-1 a -20ºC en lugar de 0ºC podría aumentar significativamente la supervivencia del tejido cerebral. El principal problema es una viscosidad muy alta de 70% VM-1 a -20ºC, aunque CI-VM-1 es menos viscoso que otros VM. Necesito realizar más experimentos para intentar solucionar el problema.

También realicé experimentos para estudiar la posibilidad de enfriar más rápidamente la cabeza de un paciente a través de sus vasos sanguíneos usando fluidos inertes después de la saturación de la cabeza con VM. Los modelos para la cabeza humana fueron cabezas de rata y oveja.

Ben Best me propuso usar trehalosa y sacarosa para intentar disminuir las concentraciones de CPA en VM-1. Estaba y ahora estoy en contra de la disminución de las concentraciones de CPA en VM-1 porque esto disminuirá la estabilidad de la vitirificación cerebral y, por lo tanto, puede resultar en la desvitrificación y la formación de hielo. Mis experimentos con trehalosa y sacarosa mostraron la disminución de la estabilidad de la vitirificación del corte cerebral. La cristalización del hielo es un proceso muy poderoso, por lo que no debemos disminuir la concentración de VM-1. Propongo otra forma de aumentar la supervivencia del tejido cerebral, a saber, aumentar la resistencia de los tejidos cerebrales a los efectos tóxicos de VM-1.