por Yuri Pichugin, PhD, Criobiólogo del personal, Cryonics Institute
Para mi tercer año de investigación en el Cryonics Institute, pude realizar 112 experimentos.
En 2003 elaboré el mejor método de vitrificación para cortes de hipocampo de rata. Este nuevo método permite conservar en promedio un 85% de las células de los cortes del cerebro después de un enfriamiento lento a -130ºC. Sin embargo, la aplicación de este método a cerebros completos encontró un gran obstáculo en forma de una fuerte deshidratación de los cerebros durante la perfusión crioprotectora. El cerebro perdió del 40 al 60% del volumen inicial y no se pudo restaurar ni siquiera con una perfusión a muy largo plazo. La deshidratación cerebral excesiva fue un factor nocivo. La causa de este problema fue una permeabilidad muy baja de la barrera hematoencefálica para los agentes crioprotectores. Este problema no se había resuelto en la ciencia antes de mi trabajo. No tuve ese problema con las delgadas rodajas de cerebro porque podían saturarse con mezclas de vitrificación por simple difusión.
Aparentemente, fui el primero en el mundo en encontrar compuestos que pudieran abrir completamente la barrera hematoencefálica para concentraciones elevadas de crioprotectores. Entonces, ahora puedo saturar todo el cerebro con mezclas de vitrificación sin deshidratarme. Es un gran descubrimiento para la ciencia y la tecnología criónica. Obtuve casi el 100% de supervivencia celular después de la perfusión de cerebros de ratas adultas con 40% de etilenglicol con la apertura de la barrera hematoencefálica y solo tuve un 30% de supervivencia celular en las mismas condiciones experimentales pero sin abrir la barrera. ¡Es una gran diferencia!
Intenté adaptar el nuevo método de vitrificación para su uso futuro cercano en pacientes con IC en condiciones reales de funerarias. Para las rodajas de cerebro, obtuve los mejores resultados saturando las rodajas con la mejor mezcla de vitrificación a -25ºC durante el período de tiempo óptimo de 15 minutos. La supervivencia del tejido cerebral dependía en gran medida del tiempo de exposición y la temperatura. Los directores de la funeraria no pueden utilizar -25ºC sino solo 0ºC para la perfusión del paciente. El uso de 0ºC en lugar de −25ºC para perfundir cerebros completos de ratas con una mezcla de vitrificación al 65% durante el tiempo óptimo resultó en una supervivencia celular promedio del 45% solamente. La supervivencia celular promediará solo el 26% si el tiempo de exposición es de 30 minutos en lugar de 15 minutos a una temperatura de exposición de 0ºC. El período de tiempo para la saturación completa de los cerebros de los pacientes con la mezcla de vitrificación suele ser más largo que el óptimo.
También estudié la influencia de la isquemia cálida en la viabilidad de los cortes de cerebro de rata. Las ratas después de su muerte fueron sometidas a exposiciones de 10 minutos, 30 minutos y 60 minutos a 22ºC y luego se mantuvieron en un refrigerador a 0ºC durante 8 horas. La viabilidad del corte de cerebro fue del 95% durante 10 minutos de isquemia caliente. Fue del 60% durante 30 minutos de isquemia cálida y solo del 40% durante 60 minutos de exposición cálida. La isquemia caliente es un factor mucho más dañino que la isquemia fría. Un período de tiempo post-mortem realista o típico para los pacientes puede ser de 60 minutos de isquemia caliente y de 8 a 12 horas de isquemia fría. Mis experimentos con el período de tiempo post-mortem real demostraron que la supervivencia del tejido cerebral era solo del 7% según el ensayo de relación K / Na después de la perfusión de las cabezas de rata con la mejor mezcla de vitrificación a 0ºC.
El ensayo de relación K / Na es una prueba muy confiable de viabilidad celular y tisular. El progreso en la investigación criónica no puede ser posible sin el uso de este método de evaluación. Pero el ensayo de relación K / Na funcional, muy sensible, no puede funcionar bien en algunos casos, por lo que debemos utilizar métodos de evaluación estructural y morfológica, como la microscopía óptica y electrónica. Sin embargo, estos métodos de evaluación morfológica son mucho más costosos, más complicados, menos disponibles y menos claros que el ensayo de K / Na. Ya hemos recibido algunos resultados de microscopía óptica y electrónica de laboratorios de Florida y Canadá, pero tenemos algunos problemas en este campo. Este trabajo se continuará para obtener resultados más claros.
La perfusión adecuada de pacientes reales con mezclas de vitrificación, así como con glicerol, es el problema más difícil para la criónica debido al mal estado del sistema cardiovascular para la mayoría de los pacientes y algunas otras causas. Especialmente, es cierto para el cuerpo de un paciente. Por ahora, es imposible saturar el cuerpo del paciente con mezclas de vitrificación para conseguir su vitrificación uniforme y estable. Es una de las razones por las que Alcor no ofrece vitrificación del cuerpo del paciente. Creo que el Cryonics Institute tampoco debería intentar vitrificar el cuerpo en la actualidad, sino utilizar un crioprotector diferente que seguirá mostrando una mejora con respecto a los métodos anteriores. El costo de todas las soluciones de perfusión para la cabeza de un paciente será de aproximadamente $ 50 dólares solamente. La duración de la perfusión de la cabeza será de aproximadamente 2 horas.
No habrá casos típicos estándar para los pacientes con el fin de usar una cantidad estándar fija de mezcla de vitrificación para obtener una vitrificación uniforme y estable. Mis experimentos con cabezas de oveja demostraron que debemos controlar la adecuación de la saturación del cerebro en todo momento. Para esto, traté de usar agujeros de trépano en el cráneo y midiendo los índices de refracción del fluido de los agujeros para conocer la saturación completa de los cerebros con la mezcla de vitrificación para obtener una vitrificación estable. Este trabajo aún está en curso. Será muy útil para nosotros probar el método de vitrificación en un paciente con IC antes de un anuncio oficial de que el Cryonics Institute ofrece a los miembros de IC el método de vitrificación.
Tengo planes de algunas mejoras posteriores del método de vitrificación. Diseñaré y realizaré una cámara de enfriamiento que permita realizar la perfusión vitrificación de la cabeza de un paciente a −25ºC. Elaboraré un procedimiento de enfriamiento más rápido de la cabeza de un paciente a través de sus vasos sanguíneos. Propondré diseñar y construir termocontenedores más perfectos y fiables para el enfriamiento uniforme de los pacientes con velocidades de enfriamiento muy lentas desde −130ºC hasta la temperatura del nitrógeno líquido para evitar romper el cerebro de los pacientes.
Tengo muchos materiales experimentales que me gustaría publicar en revistas científicas. Pero por ahora puede que no haga esto porque tenemos que tomar nuestra decisión si aceptamos patentes o no. En cualquier caso, me gustaría ofrecer algunos laboratorios de investigación y bancos de tejido cerebral para demostrar nuestros logros en el campo de la criopreservación de cortes cerebrales animales y cerebros completos. Además, me gustaría ofrecer a Alcor que compare el método de vitrificación CI con el método de vitrificación de Alcor utilizando ratas.
