jueves, 26 de noviembre de 2020

Desarrollo aperture barrera hematoencefálica para maximizar la supervivencia cerebral en criónica:

 

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PPA: método de criopreservación de cerebros completos
Información de propiedad: propiedad del Cryonics Institute
Solicitud de patente provisional
Título:
Método de criopreservación de cerebros completos
Inventor:
Yuriy Pichugin
24355 Sorrentino Ct.
Municipio de Clinton
MI, 48035
Referencia cruzada a aplicaciones relacionadas: ninguna
Investigación patrocinada por el gobierno federal: Ninguna
Listado de secuencias: Ninguno
Documentos de referencia:
DOCUMENTOS DE PATENTE DE EE. UU.
5.592.168 Septiembre de 1999 Wowk, et al
6.395.467 Mayo de 2002 Fahy, et al.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
El campo de la invención es la criobiología y la criónica.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La criobiología comenzó a desarrollarse en 1949 cuando los agentes crioprotectores (CPA)
descubierto para la criopreservación de suspensiones celulares. Aproximadamente 200 compuestos han sido
probado como CPA. Sin embargo, el número de crioprotectores efectivos está limitado por veinte
derivados de las tres clases químicas, a saber, polioles (dioles, glicerol), amidas y
sulfóxidos (YI Pichugin, Problems of Cryobiology 2: 3-9, 1993). Los mejores CPA son

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glicerol, dimetilsulfóxido, etilenglicol, 1,2-propanodiol, dimetilformamida, 2,3-
butanodiol, dimetilacetamida, 2-metoxietanol.
La cristalización intracelular del agua es un factor muy dañino para los sistemas biológicos durante
su criopreservación. Los CPA se utilizan para prevenir esta cristalización intracelular. Hay un
gran diferencia entre las suspensiones de células criopreservantes en comparación con
criopreservar tejidos y, especialmente, criopreservar órganos completos. Las suspensiones celulares pueden
ser criopreservados por congelación. Los tejidos no se pueden criopreservar con éxito mediante congelación.
La congelación es un proceso de formación de cristales de hielo que puede dañar las células. La vitrificación es un
proceso de enfriamiento de materiales biológicos con crioprotectores a -130ºC o menos sin hielo
formación.
El método de vitrificación fue descubierto principalmente por GM Fahy en 1981-1984. Desde eso
tiempo que muchos investigadores han intentado utilizar la vitrificación para la criopreservación de varios tejidos
y órganos. Los investigadores han logrado vitrificar pequeños tamaños de tejidos, pero han
no ha tenido éxito en criopreservar órganos enteros como riñones, hígados y corazones para
trasplante. El principal problema al intentar vitrificar órganos es el requisito de utilizar
altas concentraciones (60-65%) de CPA para vitrificarlos a velocidades de enfriamiento relativamente lentas y
para evitar la desvitrificación a ritmos lentos de calentamiento. Hasta hace poco, los investigadores no podían
superar por completo la toxicidad de estas altas concentraciones para los órganos (GM Fahy
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et al., Cryobiology 48: 22-35, 2004). La toxicidad de los crioprotectores en los métodos de vitrificación ha
ha sido el factor limitante para la recuperación de sistemas biológicos.
La criónica utiliza los logros de la criobiología para criopreservar cuerpos humanos enteros o
cabezas después del pronunciamiento legal de la muerte. Criopreservación de todo el cerebro humano mediante
la vitrificación es un objetivo principal de la criónica. Anteriormente algunas mezclas de vitrificación (VM)
se encontraron para la conservación de tejidos renales y vasos sanguíneos. GM Fahy y col.
desarrolló mezclas de vitrificación con baja toxicidad, como VM-3 y M22 para
criopreservación de riñones de conejo (GM Fahy et al., Cryobiology 48: 157-178, 2004). En
2006, artículo dedicado al estudio de algunas VM (Vegs y VM-3) para la vitrificación de
Se publicaron cortes finos de hipocampo de rata (YI Pichugin et al., Cryobiology 52: 228-240,
2006). Sin embargo, las rápidas tasas de enfriamiento y calentamiento que se emplearon para obtener
La supervivencia muy alta de pequeñas partes del tejido cerebral no se puede utilizar para criónica.
tecnología.
Uno de los principales problemas de la criopreservación de cerebros completos es su grave deshidratación.
durante la perfusión de VM. Todos los CPA tienen tasas de penetración mucho más lentas a través de los
barrera hematoencefálica que el agua. El agua sale del cerebro mucho más rápido que los CPA
entrar en el cerebro durante la perfusión de CPA. Como resultado, la deshidratación severa del cerebro.
ocurre durante la perfusión. La deshidratación severa es un factor muy dañino porque
aumenta drásticamente la toxicidad del CPA. Los CPA penetran en cortes cerebrales delgados por simple
difusión y así las rodajas no experimentan una deshidratación severa.
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BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN
La invención proporciona un método que fue especialmente diseñado para vitrificar cerebros completos.
Todos los métodos de congelación o vitrificación conocidos dan como resultado una supervivencia muy pobre de las células cerebrales.
de cerebros enteros después de su criopreservación. Este nuevo método puede aumentar significativamente
supervivencia de las células cerebrales. Este método se denominará CI (Cryonics Institute)
método de criopreservación.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE EL INVENTO
La vitrificación produce resultados mucho mejores (recuperación promedio del 80%) que la congelación (alrededor del 20%
recuperación) para la criopreservación de tejidos biológicos (tejidos contráctiles, cartílago y sangre
buques (MJ Taylor et al, en: Life in the Frozen State, BJ Fuller et al, eds., CRC Press,
2004, págs. 603–641). Los métodos de congelación no han sido eficaces para criopreservar
tejidos. Varios CPA en diversas concentraciones (15% a 60%), modos de exposición a CPA,
Se probaron las velocidades de enfriamiento y calentamiento y las temperaturas finales de congelación. Sin embargo, congelando
los métodos no dieron buenos resultados. La supervivencia máxima de los tejidos cerebrales después
la congelación fue solo alrededor del 20% del control.
TOXICIDAD CRIOPROTECTANTE
El estudio del método de vitrificación se inició probando la toxicidad del mejor individuo
CPA en cortes de hipocampo de rata. En el estudio se utilizaron cortes de hipocampo de rata adulta como
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modelo muy utilizado del tejido cerebral en neurociencia. El ensayo de la relación K + / Na + fue
seleccionado para estudio porque es una prueba funcional sensible para evaluar la viabilidad de
tejidos biológicos.
En primer lugar, los mejores CPA no deben tener ningún efecto tóxico o al menos una toxicidad muy baja en
concentraciones (50% a 70%). Sin embargo, la práctica criobiológica ha demostrado que no existen
compuestos completamente no tóxicos en concentraciones superiores al 50-55% para biológicos
tejidos. Incluso compuestos neutros como etilenglicol y glicerol en una concentración del 60%
tienen un cierto efecto tóxico moderado sobre los tejidos cerebrales según el ensayo de relación K + / Na + .
Ninguno de los CPA individuales es bueno para el método de vitrificación. Para disminuir la toxicidad de CPA
y para aumentar la eficacia de la vitrificación de CPA, se debe utilizar una mezcla de CPA.
Los métodos de vitrificación emplean una mezcla de CPA, pero no de CPA individuales. Específico,
La toxicidad bioquímica de las mezclas de CPA puede ser bastante menos tóxica que la toxicidad del individuo.
CPA que tienen las mismas concentraciones que las mezclas de CPA porque la concentración efectiva
de cada CPA individual es menor en las mezclas.
Se eligieron cinco CPA como los mejores CPA potenciales para mezclas de vitrificación. Éstas eran
etilenglicol (EG), glicerol (GL), 1,2-propanodiol (PG), dimetilformamida (DMF),
y dimetilsulfóxido (DMSO). El número de CPA tóxicos relativamente bajos se limita a
estos compuestos. Era racional usar el CPA menos tóxico en una concentración más alta que
los otros CPA más tóxicos para una mezcla de vitrificación. Este CPA fue nombrado el principal
CPA o el componente básico de la mezcla de vitrificación. EG fue seleccionado como el principal
CPA porque es el menos tóxico para los tejidos cerebrales. 1,2-propanodiol, dimetilformamida,
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y el dimetilsulfóxido no debería ser el componente básico de las VM porque son demasiado
tóxico para este papel.
El glicerol tiene casi el mismo efecto tóxico sobre los tejidos cerebrales que el EG. Podría ser considerado
para su uso como CPA principal por este motivo. Sin embargo, el glicerol tiene una viscosidad muy alta y
muy baja eficiencia de vitrificación, por lo que no se puede utilizar como CPA primario en
mezclas de vitrificación. Además, el glicerol penetra muy lentamente a través del cerebro sanguíneo.
barrera y demasiado lentamente en los tejidos y células cerebrales. Como resultado, el glicerol causa un exceso
deshidratación del cerebro, tejidos y células. El uso de glicerol como componente básico en
Los VM aumentan su viscosidad varias veces. Estas propiedades negativas del glicerol hacen
la perfusión de cerebros y cuerpos enteros es ineficaz. 1,4 y 2,3-butanodioles son muy similares
al glicerol en este sentido.
Los CPA secundarios en VM pueden ser glicerol, 1,2-propanodiol, dimetilformamida y
dimetilsulfóxido. Se encontró que el mejor CPA secundario para VM es DMSO.
El efecto tóxico de las mezclas de CPA dependió significativamente de la temperatura de exposición. Uno
Una de las leyes más importantes de la criobiología es que la toxicidad del CPA puede disminuir a menores
temperaturas. Por tanto, los tejidos cerebrales deberían estar saturados de VM a bajas temperaturas. los
La temperatura más alta para el inicio de la exposición al CPA es 0ºC. El menos tóxico
Los crioprotectores se utilizan al comienzo de la saturación de cortes cerebrales con VM.
Los experimentos con cortes de hipocampo de rata demostraron que las soluciones de EG al 30-35% no son
tóxico a 0ºC. Los puntos de fusión de las soluciones EG preparadas en la solución de vehículo CI-VM fueron:
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4,3ºC para 10%, -9,5ºC para 20%, -14ºC para 30% y -23,5ºC para 40%. Para disminuir la toxicidad
de CPA secundarios más tóxicos, los cortes cerebrales deben exponerse con ellos en
temperaturas inferiores a 0ºC. Saturación de las rodajas con 30% EG o 40% EG permitido
combinándose con CPA secundarios a -14ºC o -23ºC, respectivamente, disminuyendo el CPA tóxico
efectos. Este procedimiento de saturación fue nuevo en comparación con los procedimientos anteriores.
de otros investigadores, por ejemplo el Dr. Fahy et al. Los mejores métodos de vitrificación han sido
descrito por el Dr. Fahy et al (patente de EE.UU. 6.395.467). Los términos criobiológicos estaban bien definidos
en esa patente, que fue elegida como prototipo para la mejora de la vitrificación
procedimientos.
Se estudiaron las toxicidades de numerosas mezclas de los mejores CPA. La mezcla de EG y
DMSO produjo los mejores resultados en la criopreservación de tejido cerebral. Esta solución fue
denominada CI-VM-1 (la mezcla de vitrificación del Cryonics Institute). CI-VM-1 puede
criopreservar cortes cerebrales con una supervivencia de hasta el 100% utilizando CI-VM-1 al 48-50% para
tasas de enfriamiento y calentamiento y con hasta un 85% de supervivencia utilizando 65% CI-VM-1 para el
tasas más lentas. La composición de EG y DMSO en la mezcla de vitrificación debe ser
variaba dependiendo de las tasas de enfriamiento y calentamiento.
La toxicidad de los crioprotectores en los métodos de vitrificación será el factor limitante para la supervivencia de
tejidos cerebrales si otros parámetros de los procedimientos de vitrificación están perfectamente optimizados. UNA
El indicador final de un procedimiento de vitrificación perfecto es que la viabilidad del tejido antes del enfriamiento.
(un indicador de toxicidad de CPA) se retiene sin cambios (dentro del error experimental) después de
enfriamiento y calentamiento.
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Es muy importante para la perfusión de cerebros humanos completos tener en cuenta la viscosidad de
VM y permeación de CPA a través de la barrera hematoencefálica, así como en el cerebro
tejidos y células. CI-VM-1 que contiene solo EG y DMSO tiene baja viscosidad y relativamente
buena permeabilidad a bajas temperaturas. Sin embargo, las soluciones portadoras conocidas aumentan la
viscosidad de las máquinas virtuales y puede hacerlas inestables para el almacenamiento a baja temperatura. Un nuevo tipo
de solución portadora fue diseñada para CI-VM-1. Esta solución se denomina portadora CI-VM
solución. La solución portadora CI-VM tiene una composición muy simple, a saber, 28 mM / L
cloruro de potasio, glucosa 230 mM / L y el tampón orgánico TRIS-HCl 10 mM / L.
Un problema más importante de la criopreservación de cerebros completos es su grave
deshidratación durante la perfusión VM. Todos los CPA tienen tasas de penetración mucho más lentas a través de
la barrera hematoencefálica intacta (BBB) ​​que el agua. El agua sale mucho más del cerebro
rápidamente de lo que los CPA ingresan al cerebro durante la perfusión de CPA. Como resultado, severo
la deshidratación del cerebro ocurrió durante la perfusión. La deshidratación severa es muy dañina.
factor porque aumenta drásticamente la toxicidad del CPA. Los CPA penetran en el cerebro delgado
rodajas por difusión simple y así las rodajas no tienen deshidratación severa.
EL ESTUDIO DE LOS DETERGENTES COMO MODIFICADORES DEL CEREBRO SANGUÍNEO
BARRERA
Se puede obtener un gran beneficio mediante el uso de modificadores BBB. Por ejemplo, 30%
El etilenglicol (EG) no es tóxico para los tejidos cerebrales en determinadas condiciones. Rata
9
las rodajas de hipocampo expuestas a 30% de EG a 0ºC tuvieron una supervivencia del 100% según el K / Na
ensayo de relación. Cerebros de rata perfundidos con 30% de EG a 0ºC sin modificadores de BBB
tenía sólo alrededor del 40% de supervivencia. Los cerebros tenían aproximadamente un 35% de deshidratación. Cuando los modificadores
de las BBB de rata, los cerebros retuvieron sus volúmenes normales durante la perfusión. Como
como resultado, los cerebros de rata que fueron perfundidos con 30% de EG a 0ºC con la concentración adecuada
de los modificadores BBB tuvieron una supervivencia del 100%.
La tarea principal fue modificar la BBB para que el cerebro retenga su volumen normal durante
Perfusión VM. Estudiamos doce compuestos de la clase química detergente. Cuatro de
doce compuestos mostraron una actividad deseable. Los describimos como modificadores de la sangre.
barrera cerebral o modificadores BBB.
No existe una buena teoría del efecto de los detergentes en las membranas biológicas,
células o la BBB. Los investigadores utilizan métodos empíricos para la selección de los mejores
detergentes para sus fines.
Se utilizaron ratas para probar todos los detergentes. Sin embargo, los mejores modificadores de BBB también fueron
probado en cerebros de ovejas. Los cerebros de las ovejas retuvieron el volumen durante la perfusión VM, así como
los cerebros de rata lo hicieron. El mejor de los cuatro buenos modificadores fue seleccionado para este nuevo IC
método de criopreservación.
Todos los métodos de criopreservación conocidos dan como resultado una supervivencia muy pobre de las células cerebrales de
cerebros enteros después de su criopreservación. Este nuevo método de CI aumenta significativamente
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supervivencia de las células cerebrales. El uso adecuado del método puede preservar alrededor del 80% de las células.
después de la criopreservación de cerebros completos.
EJEMPLO 1
Se estudió la toxicidad de los agentes crioprotectores individuales para el tejido cerebral de ratas.
TABLA 1.
-------------------------------------------------- --------------------------------
Toxicidad de los CPA más conocidos y utilizables para el tejido cerebral de ratas.
CPA
% de supervivencia
-------------------------------------------------- --------------------------------
etilenglicol
66,3 ± 10,4
glicerol
60,0 ± 4,8
1,2 propanodiol
31,5 ± 14,8
dimetilformamida
25,9 ± 4,0
dimetilsulfóxido
17,9 ± 2,6
dimetilacetamida
8,2 ± 1,6
2-metoxietanol
6,3 ± 1,8
metilformamida
5,1 ± 2,9
formamida
2,1 ± 0,5
-------------------------------------------------- ---------------------------------
11
Los experimentos se realizaron utilizando las mismas condiciones experimentales (exposición de 15 minutos
de los cortes de hipocampo de rata con 60% de VM a -10˚C). No hubo ningún intento de encontrar
condiciones de experimento óptimas para cada CPA.
También se probó metilacetamida, pero sus soluciones acuosas en comparación con
la dimetilacetamida no fue estable y formó precipitados durante el almacenamiento durante la noche a 0ºC.
El procedimiento de los experimentos con cortes de hipocampo de rata ha sido previamente
descrito en detalle previamente (YI Pichugin et al., Cryobiology 52: 228-240, 2006).
La supervivencia de los cortes de hipocampo después del tratamiento se expresó como un porcentaje de la
supervivencia de los controles no tratados. Este estándar de comparación se utilizó para todos los
experimentos descritos a continuación.
Está claro que cuanto menor es la supervivencia, más tóxico es el efecto del CPA. La mayoría de amidas y 2-
el metoxietanol fue muy tóxico para los tejidos cerebrales.
EJEMPLO 2
Se estudió la toxicidad de algunas mezclas de vitrificación binaria para tejido cerebral de rata.
12
TABLA 2
-------------------------------------------------- -------------------------------------------
Toxicidad de las cuatro mezclas de vitrificación binaria para tejido cerebral de rata
Composición de VM
% De supervivencia de VM,%
-------------------------------------------------- -------------------------------------------
1,2 propanodiol - dimetilformamida
40 - 25 42,7 ± 4,6
1,2 propanodiol - dimetilsulfóxido
40 - 25 35,1 ± 3,4
dimetilformamida - dimetilsulfóxido 40 - 25 28,8 ± 4,5
etilenglicol - glicerol
40 - 25 52,6 ± 4,0
-------------------------------------------------- -------------------------------------------
Los experimentos se realizaron utilizando las mismas condiciones experimentales (25 minutos
exposición de los cortes de hipocampo de rata con 65% de VM a -20˚C).
Estas VM arrojaron peores resultados que la mejor VM que contenía EG y DMSO.
Los sistemas de vitrificación como amida - DMSO - EG - PG no se exploraron en detalle
porque Fahy y Wowk ya han estudiado este sistema (Patente de Estados Unidos 6.395.467).
13
EJEMPLO 3
Se estudiaron mezclas de vitrificación de etilenglicol-dimetilsulfóxido.
TABLA 3
-------------------------------------------------- -------------------------------------
Supervivencia de cortes de hipocampo de rata antes y después del enfriamiento
Composición de VM
supervivencia
supervivencia
antes de
después
enfriamiento,%
enfriamiento,%
-------------------------------------------------- -------------------------------------
25% EG, 40% DMSO
65 ± 7
63 ± 6
27% EG, 38% DMSO
73 ± 6
69 ± 5
32,5% EG, 32,5% DMSO
80 ± 8
81 ± 4
45% EG, 20% DMSO
87 ± 2
73 ± 3
50% EG, 15% DMSO
82 ± 2
56 ± 8
-------------------------------------------------- -------------------------------------
14
La supervivencia antes del enfriamiento reflejó la toxicidad del CPA. Supervivencia después del enfriamiento reflejado CPA
actividad de crioprotección, que fue el resultado final de toda la criopreservación.
El EG - DMSO VM (50% - 20%) demostró una vitrificación menos estable que el EG -
DMSO VM (45% - 15%) lo hizo. Un mayor porcentaje de EG en VM aumentó su viscosidad.
Un mayor porcentaje de DMSO en VM disminuyó su viscosidad pero aumentó su toxicidad.
EJEMPLO 4
Se estudió la influencia de varios detergentes sobre el volumen del cerebro de rata.
TABLA 4 Los resultados de los experimentos con varios detergentes
I concentraciones óptimas en
Soluciones I m-RPS-2 VM-1 Uniformidad Reproducción
Aniónico
1. SDS
0,01%
---
incluso
normal
2. SDBS
0,006%
0,002-0,004%
incluso
medio
3. SC
0,5%
0,3-1,2%
incluso
normal
15
4. SDC
0,06%
0,05-0,2%
incluso
normal
------------------
Catiónico
5. CPC
0,01%
---
medio desigual
6. CTAB
0,01%
0,005-0,02%
desigual mal
------------------
No iónico
7. Triton X100 no
---
incluso
normal
8. Preadolescentes
No
---
incluso
normal
9. Pluronic
No
---
incluso
normal
Anfótero
10. CHAPS
0,2%
0.01-0.04%
desigual mal
Notas: 1. Las concentraciones óptimas de detergentes en la solución m-RPS-2 representan la primera
tipo de experimentos. El detergente más poderoso es SDBS porque puede proteger a las ratas
cerebros contra la deshidratación a la concentración más baja. El detergente menos potente es SC
porque requiere la concentración más alta para proteger el cerebro de las ratas contra la deshidratación.
dieciséis
2. Las concentraciones óptimas de detergentes en soluciones VM-1 representan la segunda
experimentos de tipo.
3. “Uniformidad” significa la uniformidad de saturación de los cerebros de ratas con VM-1. "Incluso"
significa una saturación uniforme y uniforme de los cerebros de las ratas con VM-1. "Desigual" significa desigual,
saturación no uniforme de los cerebros de rata con VM-1. Es un indicador muy importante.
Los detergentes con perfusión VM desigual no son buenos detergentes para esta aplicación.
4. "Reproducción" significa la reproducción de los resultados de los experimentos. También es un
indicador importante.
Los mejores detergentes para nuestros propósitos son SDC y SDBS. SC es un buen detergente, pero es
detergente mucho menos potente que el detergente SDC.
SDS y CPC no tienen suficiente solubilidad en m-RPS-2 o en soluciones VM-1 a 2-
4ºC. CTAB y CHAPS dieron una saturación de VM desigual de los cerebros.
EJEMPLO 5
Se estudió la influencia del detergente SDBS sobre la supervivencia de las células cerebrales.
17
TABLA 5 Supervivencia de cortes de hipocampo preparados a partir de cerebros de rata perfundidos con 65%
Soluciones VM-1 con varias concentraciones y cantidades de detergente SDBS a 2-4ºC
-------------------------------------------------- --------------------------
Concentra- m
Supervivencia
Supervivencia
ción,%
antes de
después
enfriamiento,%
calentamiento,%
-------------------------------------------------- --------------------------
0,007
1,00
79,1 ± 4,5
21,6 ± 3,9
0,007
1,25
46,9 ± 4,9
43,5 ± 5,9
0,007
1,50
31,7 ± 2,7
34,5 ± 1,8
-------------------------------------------------- --------------------------
0,010
1,00
80,0 ± 5,7
0,012
1,00
36,7
-------------------------------------------------- --------------------------
0,0035
1,00
36,9 ± 5,4
-------------------------------------------------- ---------------------------
Donde: Concentración,% es concentración de SDBS en 15% de EG;
m es la relación entre el peso del 65% de VM-1 y el peso de la parte superior de la rata;
La supervivencia antes del enfriamiento, el% refleja la toxicidad;
18
La supervivencia después del calentamiento, el% refleja la supervivencia celular después de pasos completos de
criopreservación del cerebro de rata;
De la Tabla 5, se puede concluir que:
1. La relación óptima entre el peso del 65% de VM-1 y el peso de la parte superior de la rata fue
1,25 para obtener la máxima supervivencia celular después de la criopreservación. Concentración de VM-1 en la rata
cerebros fue probablemente del 57% al 60%. Concentración de VM-1 en el cerebro de rata con una proporción de 1,50
fue probablemente del 60% al 65%. La concentración de VM-1 en los cerebros de ratas con una proporción de 1,00 fue
probablemente menos del 55% -57% porque la vitrificación no fue estable.
2. Las concentraciones óptimas de SDBS son del 0,007% al 0,010%. Las concentraciones eran solo
comparado con la relación 1,00.
3. Disminuir la concentración del 0.007% de SDBS dos veces disminuyó la supervivencia celular aproximadamente
dos veces.
Se estudió la influencia del detergente SDC sobre la supervivencia de las células cerebrales.
19
TABLA 6 Supervivencia de cortes de hipocampo preparados a partir de cerebros de rata perfundidos con 65%
Soluciones VM-1 con varias concentraciones y cantidades de detergente SDC a 2-4ºC
-------------------------------------------------- ---
Concentra- m
Supervivencia
ción,%
antes de
enfriamiento,%
-------------------------------------------------- ----
0,10
1,00
67,7 ± 11,0
0,15
1,00
24,5 ± 3,2
0,05
1,00
28,9 ± 2,1
-------------------------------------------------- ------
Donde: Concentración,% es concentración de SDBS en 15% de EG;
m es la relación entre el peso del 65% de VM-1 y el peso de la parte superior de la rata;
La supervivencia antes del enfriamiento, el% refleja la toxicidad;
De la Tabla 6, se concluye que las concentraciones óptimas de SDC son del 0,1% al 0,13%.
Disminuir la concentración del 0.1% de SDC dos veces disminuyó la supervivencia celular alrededor de dos
veces.
20
No fue necesario realizar todos los pasos de criopreservación para SDC porque es suficiente
tener datos de toxicidad para comparar SDC con SDBS.
RECLAMACIÓN (ES
Reclamamos:
1. Detergentes aniónicos como dodecilbencenosulfonato de sodio (SDBS), sodio
desoxicolato (SDC), dodecilsulfonato de sodio (SDS), oxicolato de sodio (SO) y
otros pueden usarse para modificar la barrera hematoencefálica para la eliminación de enfermedades cerebrales graves
deshidratación durante la perfusión crioprotectora.
2. Detergentes aniónicos según la reivindicación 1, en los que los detergentes preferidos son SDBS y SDC.
con las concentraciones óptimas 0,007% a 0,010% para SDBS y 0,08% a 0,12% para
SDC.
3. Detergentes aniónicos según la reivindicación 2, en los que SDBS o SDC se pueden utilizar en la etapa de perfusión.
con un 15% de un agente crioprotector a 0ºC para evitar edemas severos de tejidos no cerebrales.
4. Detergentes aniónicos de la reivindicación 2, en los que la mezcla de vitrificación preferible consiste en
etilenglicol y dimetilsulfóxido.
21
RESUMEN
Un método para criopreservar cerebros enteros por vitrificación, que es un método para prevenir
deshidratación cerebral severa y formación de hielo. El método incluye el uso de modificadores
de la barrera hematoencefálica durante la saturación de los tejidos cerebrales con crioprotector
agentes y enfriamiento de los tejidos saturados a negativo (-) 120ºC. La criopreservación de CI
El método es efectivo para todas las mezclas de vitrificación, pero la mezcla de vitrificación preferida
contiene etilenglicol y dimetilsulfóxido. Para modificar la barrera hematoencefálica para
Eliminación de la deshidratación cerebral severa durante la perfusión, se utilizaron algunos detergentes. los
los modificadores preferibles de la barrera hematoencefálica son el dodecilbencenosulfonato de sodio y
desoxicolato de sodio. La concentración de dodecilbencenosulfonato de sodio se puede variar
de 0,007% a 0,010%. La concentración de desoxicolato de sodio se puede variar desde 0.08%
al 0,12%.
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