Mensaje: # 2567 - Resumen técnico de BPI # 002 Fecha: 18 de enero de 94 23:32:00 EST De: Mike Darwin < 75120.575@CompuServe.COM > Asunto del mensaje: Resumen técnico de CRYONICS BPI # 002 RESUMEN TÉCNICO DE BPI # 002 Recientemente se ha debatido mucho sobre la necesidad de "criónica" o investigación sobre la criopreservación del cerebro. En nuestra opinión, un Un buen lugar para comenzar tal investigación es con una investigación sobre exactamente cuáles son las limitaciones de la tecnología actual de criopreservación del cerebro. Eso Es bastante sorprendente que las organizaciones criónicas estén gastando más de $ 400,000 al año en operaciones (con otros 200-300K que se utilizan / reservan para operaciones reales de criopreservación) sin prácticamente ninguna evidencia directa en la mano sobre cuál es la calidad de la conservación que ofrecen. Mientras Se cita mucha evidencia indirecta, actualmente (que sepamos) NO organización criónica que ofrece estudios ultraestructurales que documentan la nivel de conservación que pueden ofrecer a sus clientes en condiciones óptimas (por no hablar de condiciones subóptimas). Solicitar personas como clientes para la criopreservación es razonable, pero Creemos que debe ir acompañado de evidencia que documente lo que es REALMENTE se le hace al cliente (paciente) cuando el tratamiento es administrado. Nuestra posición es que habría menos clientes y * considerablemente * más investigaciones sobre la criopreservación del cerebro fueron tales documentación disponible. Sin embargo, en última instancia, no es la opinión lo que cuenta aquí, sino hechos. BPI y Cryovita Laboratories se comprometen a realizar esta investigación y respondiendo a esta pregunta. El protocolo de investigación que sigue es el primer paso en esa dirección. Durante el próximo año, BPI y Cryovita esperan trabajar juntos para realizar esta investigación y obtener esas respuestas. Aquellos que deseen unirse a nosotros en este esfuerzo, se les anima a hacerlo. Protocolo BPI para la investigación de la criopreservación del cerebro PROPUESTA PARA EVALUAR EL GLICEROL 6M COMO UN CRIOPROTECTANTE PARA EL CEREBRO DE MAMÍFEROS por Michael Darwin Introducción El problema central de la criopreservación humana es la preservación de el cerebro humano en un estado suficientemente intacto para permitir una reparación futura y recuperación, con restauración de la vida y la salud de las personas así tratadas (1). Un requisito previo necesario para la posibilidad de una reparación futura es que Se conserve suficiente estructura cerebral para permitir la determinación de la estado saludable y funcional del cerebro de los heridos, que no funcionan estado resultante de enfermedad, isquemia y criopreservación (es decir, la criterio teórico de la información) (2). La solución ideal a este problema sería el desarrollo de un protocolo de criopreservación que permitiría para la animación suspendida no dañina del cerebro a largo plazo. Estado actual del arte La mejor evidencia disponible, aunque está lejos de ser completa, sugiere que técnicas actuales de criopreservación de órganos que se han adaptado para su uso en la criopreservación humana causan lesiones graves, en gran parte como resultado de toxicidad (3) y daño mecánico al tejido por el hielo formado durante congelación (4, 5, 6). Estudios internos realizados en gatos adultos sometidos a protocolos de criopreservación similares a los que se utilizan actualmente en humanos Los pacientes sugieren que el cerebro puede ser uno de los criolesiones más graves. órgano (7). Microscopía electrónica de la corteza cerebral tomada de estos animales después de la perfusión de glicerol a 3 M, enfriar a -196 * C a las velocidades suspensiones humanas, calentamiento lento hasta justo por debajo de 0 * C, y fijación en el presencia de crioprotector, ha revelado lesiones graves en varios niveles. A nivel macroscópico, se produce la fractura del cerebro. Estas Las fracturas frecuentemente penetran completamente en el cerebro y resultan en fragmentación del cerebro en dos o más piezas discretas. Esta herida Se cree que es el resultado de la creación de tensiones internas asociadas con contracción al enfriarse después de la solidificación del sistema en el vidrio punto de transición (Tg). Existe evidencia tanto directa como teórica de que la fractura se puede evitar de manera segura al no enfriar el cerebro significativamente debajo de Tg. Esta parece ser una estrategia biológicamente segura, al menos para períodos intermedios de almacenamiento (años a décadas) como resultado de la detención sustancial, si no completa, de la actividad bioquímica producida por tanto la temperatura baja como el enfriamiento por debajo de Tg. A nivel histológico, existe una amplia evidencia de alteración de la arquitectura tisular, presumiblemente como resultado de la formación de cantidades de hielo que dañan mecánicamente. El neuropilo está uniformemente salpicado con cavidades de hielo de .5 a 1u de diámetro a intervalos de 2u a 5u. También hay separación frecuente del neuropilo de las membranas celulares neuronales. Ocasionalmente hay cavidades grandes del orden de 10u a 20u en de diámetro, que pueden ser cavidades de hielo o desgarros resultantes de la formación de hielo. Los capilares cerebrales suelen estar separados de la membrana basal o de neuropil. También hay evidencia de la rotura de fibras largas (como axones), presumiblemente como resultado de la formación de hielo. A nivel ultraestructural, el daño es mucho más evidente y lejano. más extendido. A menudo hay una aparente pérdida o alteración del terreno. sustancia y daño a componentes subcelulares. En particular, el las mitocondrias y la mielina parecen estar gravemente dañadas. Las mitocondrias son a menudo se presentan sólo como cavidades dilatadas, llenas de detritos con ocasionalmente crestas reconocibles. La mielina a menudo está hinchada, "triturada" o deshecha. en apariencia. Las células endoteliales rotas y los capilares están llenos de basura con desechos celulares, cavidades de hielo y espacios intersticiales con frecuencia contener escombros. También se evidencia la escasa permeabilidad del cerebro al glicerol. Muchos axones están rodeados por grandes cavidades de contracción con el axón adentro. estando deshidratado en apariencia y denso en electrones. A menudo, estos periaxonales los espacios de contracción contienen mielina deshecha u otros desechos. La naturaleza del problema Los estudios histológicos y ultraestructurales realizados por Cryovita y Alcor, así como los estudios de criopreservación de órganos reportados en la literatura, sugieren que no se está logrando una crioprotección adecuada. El especialmente malos resultados con el cerebro (el riñón y el corazón estaban mucho mejor conservados en el trabajo interno) son profundamente inquietantes. La mayoría de las teorías actuales de la memoria postula la codificación del comportamiento aprendido en las conexiones entre neuronas (8, 9, 10), o en neuronas individuales en forma de alteraciones morfología de las sinapsis (11). Interrupción generalizada del cerebro arquitectura en todos los niveles, incluido el daño a la sustancia fundamental, puede degradar los mecanismos de almacenamiento de memoria lo suficiente para evitar la recuperación de individuos sometidos a criopreservación en la actualidad. Claramente, un protocolo de crioprotección que inflige menos daño a el cerebro es muy deseable. Dicho protocolo debe, como mínimo, lograr el seguimiento: 1) ser aplicable al cerebro humano, 2) ser asequible (definido aquí como un costo no superior a 2-3 veces el coste actual de la criopreservación humana practicada por la Fundación Alcor de Riverside, CA alrededor de 1992), 3) ofrecen una reducción significativa en histología y ultraestructura interrupción del cerebro, 4) reducir o eliminar la mala penetración cerebral del crioprotector agente, y 5) tener un nivel aceptable de toxicidad. Fahy y col. (12, 13) han demostrado pruebas histológicas razonables. preservación del tejido cerebral usando concentraciones de glicerol tan bajas como 3M con una conservación superior observada a glicerol 6M. Sin embargo, la deshidratación Se observó cuando se introdujo glicerol 6 M a 10 ° C frente a 25 ° C. Se ha realizado un trabajo modesto para evaluar otros crioprotectores para el cerebro, pero en general estos agentes sufren de una o más de los mismos problemas que el glicerol: mala permeabilidad y / o la necesidad introducir concentraciones muy altas (y sin duda tóxicas) para mantener formación de hielo hasta un punto compatible con la supervivencia del órgano. La obra de Smith (14) y Storey (15) indica que, mientras que los vertebrados pueden tolerar una gran fracción de órganos o agua corporal total convertida en hielo, el límite superior parecería ser alrededor del 60%, siendo el 50% el más límite conservador. Para alcanzar este límite de formación de hielo durante criopreservación con glicerol sería necesario sustituir aproximadamente el 35% del agua de los tejidos en volumen / volumen con glicerol (16). Además, debido a la gran masa del cerebro humano, Sería necesario enfriarlo lentamente. Esto, a su vez, daría como resultado la el cerebro está expuesto al punto de congelación de equilibrio durante el enfriamiento, exponiéndolo a una concentración terminal de glicerol de> o = 68% (v / v). La situación es la misma con otros crioprotectores de uso común como 1,2 propanodiol y Me2SO (17). La necesidad de investigación adicional Los resultados observados en el estudio Alcor / Cryovita realizado a mediados de Los años 80 estuvieron sujetos a una serie de advertencias y limitaciones importantes: 1) No se realizó histología ni microscopía electrónica sobre glicerolizados cerebros perfundidos con fijador antes de la criopreservación. Así es imposible determinar qué cambios histológicos y ultraestructurales fueron el resultado de los efectos de la glicerolización y que fueron el resultado de criopreservación. 2) El tejido no se desglicerolizó después de la criopreservación y antes de fijación, lo que hace imposible determinar qué cambios se produjeron como resultado de deshidratación secundaria a la glicerolización, y que fueron como resultado de criopreservación. Además, la apariencia "comprimida" del tejido, presumiblemente como resultado de la deshidratación relacionada con el glicerol, hecho efectivo evaluación de ultraestructura imposible. Una serie de experimentos en los que los animales son glicerolizados y desglicerolizados en ausencia de La criopreservación es fundamental para comprender la (s) causa (s) de los cambios. observado. 3) El tejido no se tiñó ni se examinó a nivel de microscopía óptica y luego sometido a microscopía electrónica para permitir correlación entre los exámenes de luz y EM, ni fue un análisis histológico área precisa de la corteza cerebral examinada repetidamente. 4) Fractura grave del cerebro, que se produjo al enfriarse por debajo Tg, imposibilitó la reperfusión con fijador, introduciendo así la posibilidad de cambios autolíticos en el tejido como resultado de una mala fijación del bloqueo de tejido cerebral; un fenómeno que se sabe que ocurre en los tejidos nerviosos centrales preparado de esta manera para microscopía electrónica. 5) Ha habido cambios importantes en los protocolos de criopreservación. utilizado en seres humanos desde que se realizó el estudio Alcor / Cryovita. Lo mas relevante de estos cambios fue la introducción de glicerol 6M frente a 3M glicerol utilizado a principios y mediados de la década de 1980, y el rediseño completo de la perfundido base, incluido el uso de sacarosa, una membrana conocida crioprotector, como agente osmótico impermeabilizado. Dados los problemas con el estudio delineado anteriormente y los principales cambios en el protocolo de suspensión desde que se realizó este estudio, claramente una necesidad de investigación adicional para establecer el grado de preservación histológica y ultraestructural del cerebro de los mamíferos siendo logrado con los protocolos de criopreservación humana actualmente en uso. Investigación propuesta Se propone que Cryovita Laboratories realice un estudio para evaluar la eficacia de la criopreservación clínica humana actual protocolo empleado por Alcor. Este estudio incluye 5 experimentos relacionados como sigue: 1) Fijación pre-glicerolización. Dos animales de este grupo se someten a la anestesia, cirugía y canulación según el mismo protocolo utilizado para todos otros animales en el estudio, seguido de perfusión con fijador y preparación de tejidos para microscopía óptica y electrónica. La concentración de fijador (Karnovsky modificado) aumenta linealmente a terminal concentración durante un período de 30 minutos para evitar la deshidratación celular de efectos osmóticos. 2) Glicerolizado a 6 M a 10 ° C. Tres animales se perfunden a un terminal concentración de glicerol 6 M a una velocidad de 30 mM / min. a 10 * C, después de lo cual se perfunden con fijador que contiene perfundido de glicerol 6M. los La concentración de fijador (Karnovsky modificado) se incrementa linealmente a un concentración terminal durante un período de 30 minutos para evitar deshidratación por efectos osmóticos. A continuación, el tejido se prepara para análisis histológico. y examen ultraestructural. 3) Glicerolizado a 6 M a 20 ° C. Tres animales se perfunden a un terminal concentración de glicerol 6 M a una velocidad de 30 mM / min. a 20 * C después de lo cual se perfunden con fijador que contiene perfundido de glicerol 6M. los La concentración de fijador (Karnovsky modificado) se incrementa linealmente a un concentración terminal durante un período de 30 minutos para evitar deshidratación por efectos osmóticos. A continuación, el tejido se prepara para análisis histológico. y examen ultraestructural. 4) Glicerolizado / desglicerolizado. Se glicerolizan tres animales a 6 M a la temperatura determinada como óptima en los experimentos 3 y 4 después de lo cual se desglicerolizan utilizando un protocolo apropiado de control eliminación de glicerol empleando un antagonista osmótico (manitol). Siguiendo desglicerolización, los cerebros se perfunden con fijador y se preparan para examen histológico y ultraestructural. La concentración de fijador (Karnovsky modificado) aumenta linealmente hasta la concentración terminal sobre un período de 30 minutos para prevenir la deshidratación celular por efectos osmóticos. 5) Glicerolizado y enfriado a -80 * C Tres animales se glicerolizan a 6M, enfriado a -80 * a 4 * C por hora, recalentado de -80 * C a 4 * C por hora y perfundido con fijador a 4 ° C. La concentración de fijador (modificado De Karnovsky) se incrementa linealmente hasta una concentración terminal de más de 30 período de un minuto para prevenir la deshidratación celular por efectos osmóticos. 6) Glicerolizado, enfriado a -80 * C y desglicerolizado. Tres animales son glicerolizado a 6 M, enfriado a -80 * C, desglicerolizado al recalentar y fijador perfundido, seguido de histológico y ultraestructural examen. La concentración de fijador (Karnovsky modificado) es aumentado linealmente a la concentración terminal durante un período de 30 minutos para prevenir la deshidratación celular por efectos osmóticos. 7) Congelar la sustitución a -80 ° C después de la glicerolización y congelación. Tres animales se glicerolizan a 6 M, se enfrían a -80 * C, se seccionan en 5 mm losas y congelar sustituido en metanol-osmio por luz y electrones microscopía. Durante la glicerolización y desglicerolización de todos los grupos, se realizan los siguientes estudios de laboratorio: * determinación de la absorción de oxígeno * determinación de la absorción de glucosa * pH arterial y venoso * niveles de lactato perfundido * perfundir niveles de CK, CKMB y LDH * niveles de perfundido de sodio, potasio, cloruro y calcio Estos experimentos servirán para ampliar la comprensión del metabolismo efectos de la glicerolización y criopreservación en el centro de mamíferos sistema nervioso. Razón fundamental Los propósitos de este estudio son determinar las características histológicas, efectos ultraestructurales y metabólicos de un protocolo de criopreservación actualmente en uso por Alcor. Los conejos son el animal elegido para este estudio por los siguientes razones: 1) Un importante cuerpo de trabajos previos sobre criopreservación cerebral ha realizado en conejos, lo que proporciona una línea de base de información. 2) El costo de los ingredientes base perfundidos y los agentes crioprotectores hace que la aplicación de esta investigación a un modelo animal más grande no sea práctica. 3) Debido a limitaciones logísticas, el uso de animales más pequeños no está factible. Se prevé que se utilizarán 15 animales en el estudio como detallado en la investigación propuesta arriba. Estos números fueron elegidos para permitir cierta confianza en repetibilidad. Bienestar animal y utilidad de la investigación propuesta Sin duplicaciones innecesarias Se ha realizado una revisión cuidadosa de la literatura utilizando tanto MEDLINE y métodos manuales para determinar si existe alguna alternativa utilizando animales para obtener la información buscada en este estudio. Es el determinación del investigador principal (y consultores externos) de que El trabajo propuesto en este documento no duplica ningún experimento informado en el literatura en el momento en que se realizó la evaluación. Evitación del dolor / malestar Todos los procedimientos utilizados en este estudio evitarán o minimizarán el dolor, malestar y angustia a los animales. Dado que este es un estudio de sacrificio ningún animal se recuperará de la anestesia inicial. Todos los procedimientos quirúrgicos se realizará bajo anestesia general. El dolor / malestar será confinado a la sujeción del animal en un sujetador estándar para conejos, y el bastón auricular utilizado para obtener acceso venoso para facilitar la inducción de anestesia. Condiciones de vida / vivienda y personal Los animales serán adquiridos del proveedor la noche anterior al experimento y alojado en jaulas de acero inoxidable durante menos de 24 horas antes al inicio del experimento. Las jaulas para animales cumplen con la Parte 3, Subcapítulo A de la Ley de Bienestar Animal. El personal que realiza los procedimientos sobre los animales se ha realizado entrenados para llevarlos a cabo de manera competente y con la mínima incomodidad para el animal. El personal y sus calificaciones se enumeran a continuación: Gregory M. Fahy, Ph.D .: El Dr. Fahy es un criobiólogo profesional con Amplia experiencia en el estudio de los efectos de la criopreservación de la sistema nervioso central del conejo. Steven B. Harris, MD: El Dr. Harris es un médico con 10 años de experiencia en la investigación de animales pequeños, incluidos los conejos, en UCLA Medical Center en Los Ángeles. Michael Darwin, CRT: El Sr. Darwin es técnico de hemodiálisis y perfusionista cardiopulmonar no certificado con 12 años de experiencia en investigación con perros y conejos. Cuidado veterinario La atención médica veterinaria para animales se brindará a través de nuestro consultor veterinario. Materiales y métodos General Animal experimental El conejo ha sido el animal utilizado en la mayoría de publicaciones e inéditas. trabajar en la criopreservación del cerebro. Además, los investigadores tienen una amplia experiencia con el cuidado, manejo, anestesia, manejo quirúrgico y los efectos de la criopreservación en este animal. Por estas razones, y debido a la necesidad de contener los costos (los conejos son baratos y tienen volumen de cabezas / cerebros con una disminución resultante en los requisitos de volumen de crioprotector), se propone que el conejo se utilice para este estudio, y en particular, el conejo blanco de Nueva Zelanda. Preparación experimental Si bien el órgano objetivo de este estudio es el cerebro de conejo, la práctica Las consideraciones dictan que el cerebro se mantenga dentro de la cabeza. (cefalón) durante el protocolo de criopreservación. Trabajando con un intacto La preparación del cabezal tiene las ventajas de: 1) proporcionar protección del cerebro durante la manipulación quirúrgica, perfusión, enfriamiento, recalentamiento y reperfusión / evaluación inicial, 2) reducción del tiempo quirúrgico y nivel de habilidad quirúrgica requerido para realizar el trabajo, y 3) la mayoría aproximándose estrechamente a los modelos de cuerpo entero humano y neurosuspensión. los El modelo de cefalón también tendrá una ventaja adicional en el sentido de que generará Cantidades modestas de otros tejidos sometidos a perfusión / criopreservación, que se pueden arreglar y examinar más adelante si la financiación lo permite. Protocolo quirúrgico Se induce anestesia en conejos blancos de Nueva Zelanda que pesan al menos 4 kg mediante la administración intravenosa de 5 mg de ketamina, 0,04 mg de xilacina y 0,2 mg de atropina por kg a través de la vena marginal de la oreja. Se mantiene la anestesia por infusión intravenosa continua de xilazina y ketamina en el oído marginal vena. Una vez asegurada la anestesia, la superficie ventral del animal se afeitado, se realiza una traqueotomía y el animal se mantiene en un respirador. Luego se colocan sondas de termopar tipo T en el recto y la faringe oral y asegurada con grapas quirúrgicas o suturas para evitar movimiento o desprendimiento. El animal se coloca en una tina de hielo picado. antes del inicio de la cirugía. Se realiza una incisión de 3 cm en la superficie lateral del cuello comenzando en el borde caudal del proceso transversal de la 1ª vértebra cervical. Se inciden los tejidos subcutáneos y se identifica el músculo esplenio. y reflejado dorsalmente para exponer el intratransversarius cervicus dorsalis músculo. El intratransversarius cervicus dorsalis y el Los músculos intertransversarios intermedius se separan para exponer el arteria vertebral a medida que sale del foramen transverso del segundo vertebra cervical. La arteria se identifica y se liga con un lazo de seda. A continuación, la arteria carótida se aísla de los troncos nerviosos que se adyacente a él en la vaina carotídea, y se colocan dos ligaduras alrededor para que pueda ser canulado. Se manipulan las venas yugulares internas similar. Se colocan dos tercios de una cinta umbilical de 12 pulgadas en un espacio creado entre la vértebra cervical dorsalmente y la tráquea ventralmente. El tercio restante se deja sobresaliendo de la incisión. La herida se cubre con una gasa empapada en solución salina, se da la vuelta al conejo, y el procedimiento quirúrgico se repite en el otro lado. Una vez que se ligan las arterias vertebrales y las arterias carótidas aislado, la cinta umbilical previamente enterrada se saca de la piel incisión. La vena yugular derecha está canulada con una longitud de 2 cm de 2 mm tubo de polietileno de diámetro, que está termosellado en el extremo opuesto al el que se inserta en el recipiente. La ligadura de cinta umbilical es luego se aprieta atándolo alrededor de los músculos perivertebrales al nivel de la tercera vértebra cervical, ocluyendo así ramas musculares anastomosando con la rama occipital de la arteria vertebral. En este momento, la temperatura del conejo se habrá reducido en enfriamiento externo a aproximadamente 30 * C. Se administra heparina sódica, 30 mg / kg IV. La arteria carótida derecha se canula utilizando un ángulo recto personalizado catéter de polietileno, el extremo termosellado se corta de la punta del catéter yugular derecho y perfusión de perfusión base preenfriada para 10 * C, de la composición que se muestra en la Tabla I, se inicia a una presión de 60 mm Hg conectando la cánula de la arteria carótida a un brazo de un conector en "Y" que a su vez está conectado al aparato de perfusión. Una vez que el venoso El efluente es transparente, la temperatura del perfundido se reduce a 1 * C para 2 * C. Simultáneamente con el inicio de la perfusión hipotérmica, el la arteria carótida contralateral y la vena yugular se ligan y canulan. Una vez que se canula la segunda arteria carótida, la cánula se conecta a el otro brazo del conector "Y", la cánula yugular se abrió y La perfusión continuó a través de ambas arterias carótidas hasta que el efluente venoso es transparente y la temperatura oral es de 5 ° C o menos. Las cánulas arteriales y venosas están firmemente fijadas al músculo adyacente. usando sutura de seda, y los vasos se cortan entre las ligaduras y la cánula. La herida quirúrgica se expande lateralmente y todas las estructuras, musculares y cutáneas, se cortan con un bisturí justo debajo del nivel de la Cuarta vértebra cervical. La columna vertebral y la médula espinal están cortadas. con tijeras Mayo y la cabeza aislada se coloca en la perfusión aparato. Materiales y métodos - Fijación de preglicerolización Después de la preparación del cefalón para perfusión mediante el procedimiento arriba, se coloca en el aparato de perfusión, que ha sido cebado con fijador de Karnovosky modificado. El fijador se introduce a presión de 60 mmHg y una temperatura de 10 ° C. Fijación y preparación de cortes para microscopía óptica y electrónica se analiza a continuación. Materiales y métodos: glicerolizado / desglicerolizado Aparato de perfusión de carga / descarga crioprotectora El aparato de perfusión consta de dos depósitos de 2 litros; uno para concentrado de crioprotector y uno para el sistema de recirculación. los El depósito de recirculación se coloca encima de una mesa de agitación y se agita continuamente con un imán recubierto de teflón. El concentrado de glicerol el depósito está conectado a los depósitos de recirculación por una sección de 3/8 " tubo Tygon de diámetro. El reservorio de recirculación suministra una perfusión circuito que consta de una bomba de hemodiálisis Drake-Willock Modelo 7401, un CD Dializador de fibra hueca de bajo volumen de cebado Medical 90 SCE (sirve como oxigenador), un intercambiador de calor de aluminio extracorpóreo Gish, un Pall ECF-40 Filtro de sangre extracorpóreo pediátrico Ultipor 40u y conector en "Y" con puerto luer capaz de aceptar las conexiones de los tubos a la arteria carótida cánula y la línea de control de un transductor de presión. Tubería en el El lado arterial del sistema es PVC de grado médico en todas partes. El efluente venoso se recoge en un embudo colocado debajo de la cabeza. de una cánula de stent de 2 cm de largo en las venas yugulares y cualquier drenaje de la muñón de la cabeza, y regresó al sistema de recirculación. El embudo es conectado al depósito de recirculación con tubería de silastic de 3/8 ". Todo el conjunto de perfusión está encerrado dentro de un control de temperatura gabinete que consta de un refrigerador de cromatografía Fisher Scientific 148G, con puertas corredizas de vidrio para permitir una observación continua del sistema y capacidad de alcance para permitir el ajuste y la manipulación del controles sin pérdida del entorno de temperatura controlada que rodea el aparato de perfusión. El circuito de perfusión está equipado con una sonda termopar tipo T colocado inmediatamente antes del filtro arterial de 40 u y un Trantec 800 transductor de presión conectado al puerto luer de la arteria "Y" conector y monitoreado por un monitor Tetronix Modelo 414. El transductor y el monitor es externo al compartimiento refrigerado del aparato. Una bomba de diálisis Drake-Willock Modelo 7401 está conectada por una T a ambos el depósito de recirculación y la línea de retorno venoso. Esta bomba es entonces ajustado para eliminar el perfundido del sistema de recirculación a una tasa predeterminada, haciendo que el concentrado de glicerol fluya hacia el sistema de recirculación a la misma velocidad. Protocolo de perfusión crioprotectora El cefalón enfriado y lavado se coloca dentro del refrigerador gabinete del aparato de perfusión y colocado con una pinza Stoddard, muñón hacia abajo, sobre el embudo de retorno venoso. La perfusión de circuito cerrado es iniciado a una presión de 60 mm Hg y una temperatura de 10 ° C. Cuando se logra una perfusión de circuito cerrado estable, el crioprotector se inicia la rampa y la concentración de glicerol en el sistema de recirculación se incrementa a una velocidad de 30 mM por minuto hasta el terminal deseado concentración de glicerol 6M. Se calientan los cefalones que se van a perfundir a 20 ° C por circulación de perfundido a 20 ° C. Cuando la concentración objetivo de se alcanza el glicerol, la temperatura del cefalón se reduce a 2 * C por reduciendo la temperatura del aire y perfundido en el gabinete. Cuando el cefalón ha alcanzado 2 * C, se interrumpe la perfusión de glicerol. Glicerolizado y enfriado a -80 * C Después de la perfusión a glicerol 6 M según el procedimiento anterior, el Los tubos de conexión de la cánula carotídea y venosa están sujetos, la cánula desconectado, y el cefalón colocado dentro de una bolsa de polietileno de 3 mil y sumergido en un baño de 5 cs. aceite de polidimetilsiloxano (Silcool) preenfriado a -30 * C, 4 * C por debajo del punto de congelación de una solución de glicerol 6M, con aproximadamente 300 mOsm de sales. El cefalón se siembra con hielo y se mantiene a esta temperatura del baño hasta que la temperatura central del cefalón (como medido por la sonda TC en la faringe oral) alcanza -26 * C. El cefalon luego se enfría a una velocidad de 4 * C / h. a -80 * C, donde permanecerá durante 4 semanas. Después de la glicerolización y enfriamiento a -80 ° C, el cefalón se retirado del baño a -80 * C y transferido a otro baño a -15 * C donde se mantiene hasta que la temperatura central alcanza -20 * C, momento en el que se transferido a un baño a 0 ° C. Cuando la temperatura central alcanza 0 * C, el el cefalón se retira del baño, se coloca dentro del aparato de perfusión, y se vuelven a conectar las cánulas arterial y venosa. La cánula arterial y las líneas se limpian de aire y perfusión con la concentración terminal de glicerol alcanzado durante la perfusión crioprotectora se inicia. Fijación se logra mediante la perfusión de Karnovsky modificado en perfusión de glicerol de esta misma concentración. La introducción del fijador es lineal y gradual. adición durante un período de 30 minutos. Glicerolización, enfriamiento a -80 * C y desglicerolización Después de la glicerolización y enfriamiento a -80 * C y recalentamiento a 0 * C, el cefalón se transfiere al aparato de perfusión y la arteria y cánulas venosas reconectadas. La cánula arterial y las líneas se limpian de aire y perfusión con la concentración terminal de glicerol alcanzada durante la perfusión crioprtectiva se inicia. Luego se reduce la concentración de glicerol en el perfundido circulante (usando el reverso de la misma técnica empleada para introducirlo) a una velocidad de aproximadamente 30 mM de glicerol por minuto, usando manitol 300 mM como antagonista osmótico (18). La desglicerolización se realiza a 10 ° C. Después de la desglicerolización, el cefalón se perfunde con Fijador de Karnovsky (fijador introducido lentamente) en perfusión base y preparado para microscopía óptica y electrónica. Protocolo de adquisición de datos Todos los hitos importantes se anotan a medida que ocurren. A continuación se enumeran hitos críticos que se registran para cada animal. * Los siguientes datos se registran en la Hoja de Recolección de Datos Operativos: Peso Años Raza Condición general Tiempo basal de lactato extraído Tiempo de referencia química sanguínea extraída Lecturas iniciales de sodio, potasio, calcio y cloruro en suero Medicamentos pre e intraoperatorios Hora y dosis de anestésicos Tiempo de inducción anestésica Lecturas de temperatura de referencia (Esoph. Y rectal) Lecturas basales de pulsioximetría Hora de inicio de la cirugía Tiempo de canulación Tamaño y ubicación de la cánula Presión arterial basal, CV Gases en sangre de referencia Hora de inicio de la perfusión crioprotectora * Una vez iniciada la perfusión, los siguientes datos se registran a los 15 minutos intervalos en la hoja de recolección de datos de perfusión. (Tenga en cuenta que todos Los datos de gases y electrolitos son impresos por Nova Stat 5 en el momento se realiza la prueba). Hora Esoph Temp. Lecturas de pulsioximetría quirúrgica Temp arterial Presion arterial CVP Tasa de flujo arterial PaO2 PaCO2 PH arterial HCO3 arterial PvO2 y PvCO2 PH venoso HCO3 venoso Exceso de base Suero de sodio, potasio, calcio y cloruro concentración de glicerol arterial (por refractometría) concentración de glicerol venoso (por refractometría) % O2 en gas que se entrega al oxigenador Caudal de gas al oxigenador Observaciones * Las muestras de perfundido en tubos separadores de suero se recogen al inicio de perfusión y en intervalos de 30 minutos hasta la conclusión de la perfusión. Las muestras se centrifugan rápidamente después de la recolección. * Se indica claramente la hora en que se inicia y completa la perfusión, junto con flujos en el animal y presiones arterial y CV durante la perfusión. La resistencia vascular se calcula a partir de la presión arterial y el caudal. Pruebas de laboratorio Tanto para sangre entera como para perfundido, sodio, potasio, calcio, Las determinaciones de cloruro, glucosa, pH, pO2 y pCO2 se realizan con un Nova Stat 5 analizador de electrolitos y gases en sangre (Nova Biomedical, Boston, MA). Tejido Los niveles de saturación de oxígeno se miden con un pulsioxímetro CSI 503. Las muestras de sangre / perfundido se extraen con una jeringa y se analizan inmediatamente. Las muestras de análisis químico se recogen en un separador de suero o tapón rojo vacutainers (Becton-Dickinson, Rutherford, NJ) según corresponda, y analizados utilizando un analizador químico clínico Kodak Ektachem DT. Gas de sangre de respaldo El equipo es un Laboratorios de Instrumentación IL 1302. Equipo de respaldo para el análisis de sodio y potasio es un analizador de sodio / potasio Nova 1. Procedimiento de fijación Los cefalones que se preparan para microscopía óptica y electrónica son perfundido con Karnovsky modificado de la Composición que se muestra en la Tabla II. En aquellos casos en los que la fijación debe ocurrir antes de que el tejido sea descargado de glicerol, el de Karnovsky se prepara con el concentraciones de glicerol y se introducen mediante adición gradual lineal durante un período de 30 minutos para evitar el choque osmótico. Inmediatamente después de la perfusión con este fijador o glicerol solución fijadora, el cerebro se diseca de la cabeza y se sumerge en una mínimo 250 cc de la misma solución, recién preparada. Los cerebros se mantienen al menos durante la noche en esta solución antes de cortar bloques de tejido para microscopía. Los bloques de tejido para la evaluación por microscopía electrónica se cortarán de del lóbulo frontal derecho de la corteza cerebral y del área CA1 de la hipocampo. Los bloques de tejido tienen un grosor de 5 mm para minimizar la posibilidad de seccionar artefactos. Protocolo de sustitución por congelación Los cefalones que se evaluarán mediante sustitución por congelación son térmicamente equilibrado a -80 ° C y transferido a una mezcla de etanol al 95% y secado hielo para seccionar. Luego se usa una herramienta de manualidades Dremel para cortar coronal de 5 mm secciones del cerebro, manteniendo la hoja sumergida en el baño de etanol durante el corte. Luego, las secciones se transfieren a metanol anhidro para congelar la sustitución a -80 ° C. El baño de metanol es al menos 20 veces mayor en volumen que el bloque de tejido y se cambia después de 24 y 48 horas, y en intervalos de 1 semana durante las cuatro semanas las secciones son mantenido a -80 * C. Las muestras para microscopía electrónica son fijadas por el adición de 1% de OsO4. Las muestras para microscopía óptica se sustituyen en metanol anhidro solamente. Microscopía de luz y electrónica Los bloques de tejido para microscopía óptica y electrónica se preparan haciendo Secciones coronales de 5 mm de grosor a través de ambos hemisferios cerebrales para incluyen el área CA1 del hipocampo. Las secciones se envían a American Histolabs de Rockville, MD y consultores de microscopía electrónica de Tuscon, ARIZONA. Se utilizan una variedad de tinciones para microscopía óptica, incluidas Bodian y Hematoxilina y Eosina. Los consultores de microscopía electrónica (EMC) preparan algunas muestras en un forma en que pueden ser examinados tanto por microscopía óptica como por transmisión microscopía electrónica (TEM). EMC tomará muestras de las secciones coronales para TEM en de manera uniforme, deshidratar las muestras en etanol anhidro, incrustarlas en Epon y corte secciones delgadas con un ultramicrótomo Reichert Ultracut. Delgado las secciones se tiñen con acetato de uranilo y se examinan con un JEOL 100 CX TEM. Procedimientos para la preparación de muestras sustituidas por congelación para luz y La microscopía electrónica de transmisión sigue a las de Hunt (19). Secciones a ser preparados para microscopía óptica se transfieren a etanol preenfriado a -40 * C y se calentó lentamente a temperatura ambiente. Luego, las rodajas se fijan en HgCl2 al 1% en etanol durante 1 hora, se lavó en 0,5% de I2 en etanol y se embebió en cera. Las secciones se tiñen con tinción de Bodian y se examinan con microscopía óptica. Después de la sustitución por congelación, las muestras que se van a preparar para TEM se se deja calentar lentamente a 4 ° C antes de transferir a etanol anhidro. A continuación, se toman muestras mediante biopsia por punción en etanol y se incrustan en Epon. Las secciones delgadas se cortan con un ultramicrótomo Reichert Ultracut, teñido con acetato de uranilo y se examinó usando un JEOL 100 CX TEM. Investigación futura Se enfatiza que el objetivo principal de este estudio es evaluar la eficacia del protocolo de criopreservación humana ahora en uso clínico en Alcor en la preservación de la histología y ultraestructura del cerebro. Este protocolo es no es probable que contribuya significativamente a mejorar el resultado, pero probablemente será útil para definir el problema. En el caso de que la criopreservación después del equilibrio con 6M resultados de glicerol (como se esperaba) en resultados histológicos, alteración ultraestructural o metabólica, se necesitarán más investigaciones para descubrir técnicas menos nocivas. Proyección de alternativa crioprotectores y / o mezclas de crioprotectores utilizando un corte de cerebro El modelo propuesto por Fahy (20) es probablemente el siguiente paso más eficaz. En caso de buena conservación histológica y ultraestructural se observa con glicerol 6M, con evidencia de la conservación de metabolismo razonable (es decir, utilización de glucosa y oxígeno), el siguiente paso será realizar evaluaciones funcionales del cerebro evaluando cocientes de Na ++ / K + tisulares, electrencefolografía (EEG) y EEG con visual y potenciales evocados auditivos. TABLA I - Fórmula para el perfundido base SHP-1 ================================================ ========= Componente Concentración molar gramos / litro mM -------------------------------------------------- --------- Sacarosa 170,0 (MW 342,30) 58,19 Adenina HCl 0,94 (PM 180,6) 0,17 D-Ribosa 0,94 (MW 150,2) 0,14 Bicarbonato de sodio 10,00 (PM 84,0) 0,84 Cloruro de potasio 28,3 (PM 74,56) 2,11 Cloruro de calcio Solución al 10% (p / v). 1 (MW 111) 0,11 Cloruro de magnesio 20% (p / v) soln. 1 (MW 95,2) 0,095 Sodio HEPES 15 (MW 260,3) 3,90 Glutatión (ácido libre) 3 (PM 307,3) 0,92 Almidón de hidroxietilo ---- 50,00 Glucosa 10 (PM 180.2) 1.8 Heparina ---- 1,000 UI -------------------------------------------------- -------- Osmolalidad total: 303 El pH se ajusta a 8,0 con hidróxido de potasio. TABLA II - Composición de la solución de Karnovsky modificada Componente g / l Paraformaldehído 40 Glutaraldehído 20 Cloruro de sodio 0.2 Fosfato de sodio 1,42 Cloruro de calcio 2,0 mM pH ajustado a 7,4 con hidróxido de sodio. Cuadro III - Presupuesto propuesto -------------------------------------------------- --------------------- Cantidad Artículo Ext. Precio -------------------------------------------------- --------------------- 1 Conejos, Blanco de Nueva Zelanda $ 35.00 1 Envío (para conejos) 5,00 1 vivienda 24 horas 2.00 1 filtro, 0,2 micrones, 5,00 1 oxígeno, 20 cu. pies 2.00 1 monitor de temperatura, TC, use 5,00 2 sondas, TC, use .50 1 Calentador-Enfriador, Blanketrol, use 10.00 1 Equipo de traqueotomía, use 1.00 1 cinta, surtida .50 1 sonda, temperatura, paso de sangre, YSI, use .50 1 Pilas, surtidas, use .50 3 monitores, Tektronix, use 15.00 1 Oxigenador, (Dializador, Travenol 14:11), 22,50 1 Reservorios, use 1.00 1 filtro, arterial 34,00 1 ventilador, Harvard 5.00 1 juego de tubos, extracorpóreo 15,00 1 Instrumentos, quirúrgico 10.00 2 Cánula, venosa, tipo 1967 2.00 1 Soluciones, calibración, gasometría 15,00 1 domo, control de presión, Trantec 1.00 1 domo, control de presión, Statham 1.00 3 Transductor, Statham, Trantec, utilice 10,00 1 llave de paso de 3 elementos 6.76 1 cubeta, temperatura Sci-Med Temp 1.20 2 línea de monitor, M / M, 4 pies .40 10 perfundido, glicerol / SHP-1, litros 150,00 2 líneas de monitor, M / F, 6 pies 1.08 1 catéter, presión arterial 2,25 6 guantes, examen 4.70 1 solución de timbre, 500 cc, Viaflex 4.25 2 hojas de bisturí, n. ° 10 y n. ° 11 2,34 1 sutura, 0 seda 3,75 2 Sutura, # 2 Seda 3.00 2 Solución salina, para riego, 500 cc 3,50 1 Rompun / Ketalar, dosis .50 1 heparina, 5.000 UI 1,00 4 Gasa, 4 "x4", estéril, 10 c / u. 9.00 2 angiocat, 14 ga 8,00 1 Catéter Robinson 2.25 1 Juegos, IV, Administración 2.00 50 jeringas, 3 cc, Monoject 4,00 20 jeringas, 5 cc 4,00 5 jeringas, 20 cc, Terumo 1,75 1 refrigerante, hielo seco 28,00 1 enfriador, tasa controlada, use 20.00 1 Silcool, use 10.00 1 solvente, sustitución por congelación 24.00 1 congelador, -80 * C, use 25.00 1 Fiaxtives (formalina, de Karnovsky) 5,00 5 Evaluación, PAL 180,00 6 Evaluación, lactato, Ektachem 24.00 6 Evaluación, Química, Misc., Ektachem 24.00 1 Envío, Federal Express 18.00 2 Evaluación, Histología / Microscopía Electrónica 400,00 1 Formularios, hojas de datos 5,00 1 Secretariado, preparación de datos / manuscritos 32,50 _________ TOTAL $ 1,209.73 Personal Investigador 200,00 Asistente de investigación 100,00 _________ TOTAL $ 300.00 GRAN TOTAL $ 1,509.73 COSTO TOTAL DEL PROYECTO: $ 1,509.73 x 20 Experimentos = $ 30,194.60 Nota sobre costos de desechables: muchos de los artículos desechables, los costos de que se especifican anteriormente, son elementos que se reutilizarán. Por lo tanto, la El costo especificado refleja tanto el cargo por reprocesamiento como amortización del nuevo precio de compra del artículo desde indefinido la reutilización normalmente no es posible. -------------------------------------------------- --------------------- Referencias 1) Wowk, B., Darwin, M. Cryonics: buscando el mañana. Alcor. 12327 Doherty Street, Riverside, CA 92503. Estados Unidos, 1991. 2) Merkle, RC La viabilidad técnica de la criónica. Hipótesis Médicas 1992; 36: 6-12. 3) Clark, P., Fahy, GM y Karow AW Factores que influyen en la función renal criopreservación. II. Efectos tóxicos de tres crioprotectores en combinación con tres soluciones de vehículo en cortical de conejo no congelado rodajas Criobiología 1984; 21: 274. 4) Pegg, DE, Jacobsen, IA, Armitage, WJ y Taylor, MJ, Mecanismos de criolesiones en órganos. En Pegg, DE y Jacobsen, IA (eds): "Organ Preservación, vol. 2. 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