por Yuri Pichugin, PhD, Criobiólogo del personal, Cryonics Institute
Para mi segundo año de investigación en el Cryonics Institute (CI) pude llevar a cabo 67 experimentos con cortes de hipocampo de rata realizando 200 tareas, 9 experimentos con corazones de ratas vivas, 18 experimentos con perfusión de cabezas de ratas enteras y 8 experimentos con perfusión de cabezas de oveja.
El propósito de todos los experimentos fue crear un método de vitrificación para CI. Es posible que no informe sobre los resultados concretos de los experimentos porque el instituto probablemente tomará una patente utilizando los resultados. Las combinaciones de todos los mejores agentes crioprotectores se probaron como mezclas para la vitrificación usando cortes de cerebro de rata viva y el ensayo de relación funcional K / Na. Varias mezclas de vitrificación podrían criopreservar los cortes de cerebro con aproximadamente un 75% de supervivencia. La mejor mezcla de vitrificación podría preservar los cortes de cerebro vivos con una supervivencia del 85% después de la vitrificación a -135º. El método de CI con glicerol proporcionó solo un 20% de supervivencia del corte de cerebro en las mejores condiciones de congelación. 85% y 20% es una gran diferencia.
También intenté probar la mejor mezcla de vitrificación para corazones de ratas vivas. Un corazón puede recuperarse según el principio: todo o nada. Habrá latidos cardíacos coordinados o solo algo de fibrilación que se detendrá durante la incubación del corazón. Desafortunadamente, los corazones de rata no pudieron recuperarse después de usar la mejor mezcla de vitrificación incluso sin un enfriamiento profundo. Todos los agentes crioprotectores conocidos son tóxicos para los órganos vivos en concentraciones altas y vitrificables (55-70%), o no pueden proteger los órganos de las lesiones por congelación en concentraciones más bajas. La criobiología todavía no puede crear un método de criopreservación que pueda proteger órganos vivos como corazones, riñones, hígados y otros con una recuperación completa para el trasplante.
Hoy en día, la criónica, en contraste con la criobiología moderna, no debería esperar un método de criopreservación completamente perfecto porque los pacientes muertos legales ya tienen defectos de la naturaleza humana que resultaron en su muerte y todas las secuelas deberían curarse de las tecnologías médicas futuras. El 85% de supervivencia del tejido cerebral es un buen resultado en comparación con el método de IC de criopreservación anterior, por lo que deberíamos elaborar el mejor método para el cerebro y el cuerpo de todo el paciente. Por lo tanto, el método de vitrificación debe probarse no solo en cortes de cerebro sino también en cerebros de animales vivos enteros.
Cuando empecé a trabajar con cabezas de ratas enteras, encontré un obstáculo en forma de barrera hematoencefálica de rata. La barrera era mucho menos penetrable para los crioprotectores que los humanos y otros mamíferos como ovejas, conejos, gatos, perros, etc. Mis experimentos recientes con la perfusión crioprotectora de cabezas muertas frescas de ovejas demostraron que la barrera hematoencefálica de las ovejas es más penetrable incluso para el glicerol que para las ratas. Sin embargo, se observó un alto grado de deshidratación cerebral junto con la mejor penetración del crioprotector.
Desafortunadamente, al instituto de criónica no se le permitió trabajar con animales vivos, excepto ratas sin licencia. Obtener las licencias es demasiado caro para el Instituto. Las cabezas de oveja muertas no son buenas para este propósito. Necesito usar conejos vivos para emplear el ensayo de relación funcional K / Na sensible para cortes de hipocampo vivos. Puedo perfundir cabezas de conejo con crioprotectores, enfriarlas a –130º, mantenerlas a esta temperatura, recalentarlas, lavarlas de crioprotectores y preparar cortes de hipocampo de los cerebros de conejo lavados para evaluar su supervivencia mediante el ensayo de relación K / Na. Buscaré la posibilidad de alquilar una habitación pequeña en las universidades locales que tienen la licencia para trabajar legalmente con conejos vivos.
Mi trabajo con cortes de cerebro de rata viva fue muy útil y los resultados del trabajo no perdieron su importancia para futuros experimentos con perfusión crioprotectora de cabezas enteras porque las células cerebrales de los mamíferos no son prácticamente diferentes de un mamífero a un mamífero. Si se pueden hacer que las condiciones experimentales de vitrificación para las células cerebrales de conejo sean las mismas que para los cortes de cerebro de rata, la supervivencia celular para estos casos podría ser la misma dentro de los errores experimentales. Se ha verificado que la supervivencia celular in vitro (para cortes de cerebro) y la supervivencia celular in vivo (para un cerebro completo) eran similares, por ejemplo, para compuestos tóxicos o fármacos, si la barrera hematoencefálica era suficientemente buena penetrable para estas sustancias. .
Tengo dos tipos de planes para mi futura investigación. El primero es un plan ideal para obtener mejores resultados.
- Determinar los grados de deshidratación y penetración de glicerol para la barrera hematoencefálica humana post mortem a 0º en las condiciones estándar. Los cadáveres humanos deben estar relativamente frescos, es decir, deben mantenerse a 0º no más de 12-24 horas.
- Determinar qué tipo de animal está más cerca del ser humano en cuanto a su penetración de glicerol a través de las barreras hematoencefálicas. Deben utilizarse conejos, gatos y perros pequeños. Será una selección de un modelo animal adecuado para posteriores investigaciones.
- Seleccionar la mejor mezcla de vitrificación de las buenas mezclas de vitrificación utilizando el modelo animal adecuado y el ensayo de relación K / Na y electrofisiología.
- Probar la mejor mezcla de vitrificación utilizando cadáveres humanos muertos relativamente frescos y probando la vitrificación de sus cabezas a −130º.
- Estudiar la posibilidad de enfriar las cabezas humanas a -196º sin agrietarse.
Cumplir con el plan en los Estados Unidos sería muy difícil y costoso para CI. Creo que podría ser posible en Rusia en colaboración con científicos y crionistas rusos.
Mi segundo plan es trabajar con conejos vivos en el área de Michigan si puedo conseguir una habitación con licencia en una universidad.
- Encontrar un método óptimo de introducción de las mejores mezclas de vitrificación en las cabezas de conejo para evitar una deshidratación cerebral excesiva porque es uno de los factores más dañinos. Para ello, determinar los parámetros técnicos óptimos de perfusión de crioprotectores: velocidad de administración de crioprotectores, temperatura y velocidad de su disminución, y velocidad de concentraciones crecientes de crioprotectores en las mezclas de vitrificación.
- Verificar la completa vitrificación de las cabezas de conejo saturadas de forma óptima con la mejor mezcla de vitrificación enfriándolas a –130º.
- Encontrar un método óptimo para eliminar las cabezas de conejo de los crioprotectores y evaluar los resultados con el uso del procedimiento de preparación de cortes de cerebro de los cerebros lavados.
- A partir de los resultados, calcular los parámetros técnicos del método de vitrificación para cabezas de ovino y humano.
- Verificar los parámetros de las cabezas de ovino mediante el método de vitrificación para ellas de forma práctica.
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