por Yuri Pichugin, PhD, Criobiólogo del personal, Cryonics Institute
Pude realizar 160 experimentos este año. Los experimentos se dedicaron a tres proyectos de investigación principales.
1. Compuestos que pueden mejorar los resultados de la isquemia a largo plazo.
Los compuestos habituales que se utilizan contra la isquemia a corto plazo (es decir, antioxidantes) no podrían funcionar contra el almacenamiento en frío del cerebro a largo plazo (12-36 horas). Decidí probar algunos compuestos inusuales.
Existe un método de conservación de trozos de vasos sanguíneos con bajas concentraciones de formaldehído. Probé tres compuestos de la clase química de los aldehídos para verificar la posibilidad de la llamada anabiosis química. Los aldehídos que probé fueron formaldehído, acetaldehído y glutaraldehído. Usé concentraciones muy bajas y no tóxicas de estos compuestos.
Una pregunta de este estudio fue ¿podrían los aldehídos modificar de manera reversible las estructuras celulares finas para que la célula se vuelva más resistente a la isquemia fría a largo plazo? ¿Podrían los aldehídos "unirse", "arreglar" de manera reversible los eslabones débiles en las estructuras celulares moleculares que están sujetas a los efectos dañinos del frío a largo plazo?
Las partes superiores de las ratas se perfundieron con diversas concentraciones no tóxicas de aldehídos a 0ºC y se almacenaron durante 24 horas a 0ºC. La supervivencia del cerebro se evaluó mediante el método habitual de corte de hipocampo que realicé. No se encontró ningún efecto positivo de los aldehídos.
2. Otro proyecto fue el estudio de los bloqueadores de hielo 12CM .
El 21CM emplea bloqueadores de hielo al 1% X-1000 y% Z-1000 en sus VM.
Supongo que las velocidades de enfriamiento y calentamiento de los pacientes son de 0,3º / min. Encontré que la concentración mínima (crítica) de CI-VM-1 requerida para vitrificar un volumen de 20 ml sin los bloqueadores de hielo era del 55% en enfriamiento a -130ºC (y recalentamiento) a 0.3º / minuto. 52% CI-VM-1 sin bloqueadores de hielo da como resultado cristales de hielo. Fue 52% CI-VM-1 con los bloqueadores de hielo. 50% CI-VM-1 con los bloqueadores de hielo da como resultado cristales de hielo
Los resultados de la prueba de toxicidad fueron los siguientes:
86,1% de viabilidad ± 5,8% para una concentración de 55% CI-VM-1 sin bloqueadores de hielo
Viabilidad del 89,6% ± 6,2% para una concentración de CI-VM-1 al 52% con bloqueadores de hielo
El ensayo de toxicidad se realizó utilizando proporciones de potasio / sodio.
Mis experimentos con los bloqueadores de 21CM mostraron que los bloqueadores pueden disminuir la concentración efectiva de CI-VM-1 requerida para la supervivencia en aproximadamente un 3%. Los bloqueadores de hielo pueden ser valiosos para la criopreservación de órganos, pero no son tan importantes para la criónica.
Hay muchos más factores dañinos para los pacientes criónicos que el insignificante aumento de la toxicidad debido a un aumento del 3% en la concentración de mezclas de vitrificación. Ni siquiera tomo en cuenta la permeación de los bloqueadores a través de la barrera hematoencefálica y las membranas celulares. Para conseguir el mismo efecto, podemos utilizar un 3% más de CI-VM-1 en lugar de un 3% de bloqueadores de hielo (lo que sería mucho más caro).
3. Un importante proyecto de investigación que realicé fue un método de vitrificación para pacientes que no han experimentado tiempos de isquemia prolongados.
La isquemia fría de 12-24 horas redujo la supervivencia de los tejidos cerebrales al 40% del control. Debemos crear para los miembros de CI un método mejorado de vitrificación de CI con la mejor criopreservación posible de los tejidos cerebrales. Para esto, en primer lugar, los pacientes potenciales con IC deben evitar largos tiempos de isquemia organizando un equipo de reserva y mudándose a Michigan cuando se encuentren en una condición terminal.
Un problema más significativo de la criopreservación de cerebros completos es su deshidratación severa durante la perfusión VM. Todos los agentes crioprotectores (CPA) tienen tasas de penetración mucho más lentas a través de la barrera hematoencefálica intacta que el agua. El agua sale del cerebro mucho más rápidamente de lo que los CPA ingresan al cerebro durante la perfusión de CPA. Como resultado, se produjo una deshidratación grave del cerebro durante la perfusión. La deshidratación severa es un factor muy dañino porque aumenta dramáticamente la toxicidad del CPA. Los CPA penetran en finas rodajas cerebrales por simple difusión, por lo que las rodajas no tienen deshidratación grave.
Como ejemplo del gran beneficio que puede obtenerse mediante el uso de la sustancia X, el etilenglicol (EG) al 30% no es tóxico para los tejidos cerebrales en determinadas condiciones. Los cortes de hipocampo de rata que se expusieron a EG al 30% a 0ºC tuvieron una supervivencia del 100% según el ensayo de relación K / Na. Los cerebros de rata que fueron perfundidos con 30% de EG a 0ºC sin la Sustancia X solo tuvieron alrededor del 40% de supervivencia. Los cerebros tenían aproximadamente un 35% de deshidratación. Cuando modifiqué la BBB de rata con Sustancia X, los cerebros retuvieron sus volúmenes normales durante la perfusión. Como resultado, los cerebros de rata que fueron perfundidos con 30% de EG a 0ºC con la concentración adecuada de Sustancia X tuvieron un 100% de supervivencia.
La tarea principal del proyecto fue modificar la BBB para que el cerebro mantenga su volumen normal durante la perfusión de VM. Estudié doce compuestos de las cuatro subclases químicas de la clase a la que pertenece la Sustancia X. Cuatro de los doce compuestos mostraron una buena actividad deseable. Los describo como modificadores de la barrera hematoencefálica o modificadores BBB.
Probé los mejores modificadores en cerebros de ovejas. Los cerebros de las ovejas retuvieron el volumen del cerebro durante la perfusión VM, así como lo habían hecho los cerebros de las ratas. Se seleccionó el mejor de los cuatro buenos modificadores para el nuevo método de criopreservación de IC para pacientes que no han experimentado largos períodos de isquemia.
No tiene sentido usar modificadores de BBB para quienes han experimentado largos períodos de isquemia porque la isquemia destruye la BBB para que el cerebro no tenga una deshidratación severa. Determiné los límites de duración de la isquemia fría para el uso óptimo de los modificadores BBB. Se debe utilizar la concentración completa del mejor modificador BBB para la perfusión VM de cerebros de rata y oveja hasta la isquemia fría de 9 horas. Debemos utilizar sólo la mitad de la concentración del modificador entre 9 horas de isquemia fría y 18 horas de isquemia fría. No debemos utilizar ningún modificador BBB para la perfusión de VM del cerebro después de 18 horas de isquemia fría porque pueden causar edema tisular.
Todos los métodos de criopreservación conocidos dan como resultado una supervivencia muy pobre de las células cerebrales de cerebros completos después de su criopreservación. Este nuevo método de CI aumenta significativamente la supervivencia de las células cerebrales. El uso adecuado del método puede preservar aproximadamente el 80% de las células después de la criopreservación de cerebros completos. CI presentó una solicitud de patente provisional para el método.
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